197930. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alacsony viszkozitású, nagy molekulájú, szűréssel sterilizálható hialuronsav előállítására
197930 8 Azt találtuk, hogy a hőkezelés a paraméterek széles határán belül hatásos, amely határok bizonyos mértékben függnek a kiindulási anyag viszkozitásától. Különösen előnyös tartomány a 7—20 nap és 55—80°C közötti hőmérséklet nyitott edényben. Ügy tűnik, a viszkozitáscsökkenést gátolja, ha a hőkezelést zárt edényben végezzük. A szűrés munkamódszere: A szűrési technika során a viszkozitás csökkenése a pórusmérettől, az áramlási sebességtől és a valóságos szűrések számától függ. A módszert legalább 1 tömeg%-os vagy ennél töményebb HA oldatoknál célszerű alkalmazni, mivel hígított oldatban a molekulák nincsenek eléggé összekapcsolódva ahhoz, hogy a szűrő pórusain áthaladva konfigurációszerű változást szenvedjenek. Ilyen koncentrációknál a viszkozitás elég magas a szűrés különböző speciális lépéseinek, így nagy nyomás vagy vákuum alkalmazása és a szűrési felület és a szűrt térfogat közötti nagyobb arány igénybevételéhez. Minél kisebb a pórusméret (mintegy 0,5 pm alatt), és minél nagyobb a nyomás vagy a vákuum, annál alacsonyabb lesz a viszkozitás. Ezenkívül a viszkozitáscsökkenést közvetlenül befolyásolja a szűrések száma. A 4. táblázat a szűrés fenti hatásait mutatja. A cellulóz-nitrát szűrőt 165—340 mbar vákuumban alkalmaztuk. A viszkozitásezesetben is a móltömeg változása nélkül csökken. Feltehető, hogy erre a célra valamennyi filtermátrix anyag felhasználható. Megjegyezzük, hogy a HA vagy NaH átlagos körülmények között 0,22 pm-es membránszűrőn csak nehezen sterilizálható. Maga a HA vagy NaH, amelyet a viszkozitás csökkenésére, mint fent említettük pH = 11 értékre állítunk, csak nehezen megy át a szűrőn. Azt találtuk azonban, hogy a találmány szerinti hőkezeléssel olyan HA vagy NaH nyerhető, amely 0,22 pm-es szűrőn könnyen átmegy, ami lehetővé teszi a végtermék sterilizálását. Az elméleti meggondolások szerint a viszkozitás találmány szerinti csökkenése a molekula konformációját hasonló módon változtatja meg, mint a pH emelés. A nagy viszkozitású NaH vagy HA eredetileg merev oc-Helix-szerkezetét a csoportok közötti kötések hővel vagy szűréssel töíténő roncsolásával fellazítjuk. A találmány szerinti eljárás során azonban a viszkozitás csökkenés nem fordítható vissza a hőmérséklet vagy a pH egyszerű lecsökkentésével, mint ez a pH változással kiváltott viszkozitás csökkenésnél megfigyelhető. A találmány szerinti eljárások lehetővé teszik nagymolekulájú, alacsony viszkozitású HA előállítását, amely szűréssel sterilizálható. Az eljárás előnyös megvalósítási módját az 1. példában mutatjuk be. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal mutatjuk be, anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna. 7 1. példa 1. 0,5 tömeg% vagy ennél töményebb HA (vagy HA só, előnyösen kálium- vagy nátriumsó) oldatot alkalmazunk. A HA baktériumos fermentációból vagy más forrásból (vagyis kakastaréjból, köldökzsinórból vagy hasonlóból) származik. Előnyösen baktériumos eredetű HA-t alkalmazunk. A HA előállítását ismerteti például a 192 617. számú magyar szabadalmi leírás. 2. Tekercselőberendezést építünk fel, amelyben a 95%-os etanolban felvett HA oldatot az etanol mozgatása közben egy tartóedénybe vezetjük. A tekercselőberendezés a taróedénybe benyúló függőleges tengelyből és ehhez csatlakozó, hengerpalást mentén elhelyezett függőleges rudazatból áll. 3. A HA-t az etanolhoz adjuk, miközben a tekercselő az etanolt lassú-közepes sebességgel keveri. 4. A tekercselést az utolsó HA-oldat hozzáadása után mintegy 30 percen keresztül folytatjuk. 5. Miután a kicsapódott HA a tekercselőre feltekeredett, az etanolt a tartóedényből leengedjük. 6. A tartóedényt injekciós célra alkalmas vízzel töltjük meg. Bemerítjük a tekercselőt és alacsony sebességgel addig forgatjuk, amíg a HA teljesen oldódik. 7. A kívánt tisztaság, a kívánt móltömeg, vagy a kívánt viszkozitás eléréséig ismételjük a 2—6. pontokat. 8. A viszkozitás csökkentése, a nagy móltömeg megőrzése és a szűk móltömeg tartomány megtartása érdekében hőkezelést végzünk. a) A tisztított HA vagy NaH oldatokat, amelynek HA tartalma mintegy 1,2 tömeg%, a viszkózus oldat keverésére alkalmas keverővei ellátott duplafalú tartóedénybe vezetjük. b) A hőmérsékletet előnyösen 55—65°C közötti értéken beszabályozzuk. c) Az eredeti térfogat fenntartása érdekében az elpárolgott vizet injekciós célra alkalmas vízzel pótoljuk. d) A viszkozitást addig figyeljük, amíg eléri vagy túllépi az előre meghatározott, előnyösen 1,5-10—4 m2/s alatti értéket. 9. A hőkezelés után alacsony viszkozitású, nagy móltömegű, szűk móltömegtartományú és nagyfokú tisztaságú HA anyagot kapunk. A termék fénnyel és hővel szemben ellenálló. 10. A végtermék előállításához a 9. pontban leírt anyagot sterilizáljuk. Ezt előnyösen szűréssel végezzük 0,22 pm-es szűrőn. Alkal: mazható azonban hősterilizálás is. A kapott terméket hosszabb időn keresztül szobahőmérsékleten fény hatásának (több hónap) és legalább 50°€-n magasabb hőmérséklet hatásának (12 hónap) tettük ki. A kezelés során a móltömeg és a koncentráció nem változott. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
