197930. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alacsony viszkozitású, nagy molekulájú, szűréssel sterilizálható hialuronsav előállítására
197930 dik, rotációs nyíróhatást kölcsönöz és mozgó szubsztrátot eredményez, amelyen a kiváló HA megtapad- A tekercselő rozsdamentes acélrudakból vagy pálcákból áll, amelyek függőlegesen helyezkednek el és forgó tengelyen van rögzítve. Előnyös a függőleges tengely. A ten-, gelyt motor segítségével forgatjuk, amelynek sebességét szabályozni lehet. A tekercselő pontos méretét és felépítését a tartóedény nagyságától és az összegyűlő HA mennyiségétől függően változtathatjuk. Előnyösen alkalmazható a dróthálóból készített forgó hengerből álló ketrecszerű szerkezet. Az ilyen tekercselő alkalmazása során a nagymolekulájú és nagyviszkozitású HA előállítása az alábbi módon történik. A nátrium-hialuronát oldatát enyhe, adott esetben több részre osztott áramlással a terméket nem oldó folyadékkal, előnyösen etanollal töltött edénybe vezetjük. A folyadékkal érintkezve a termék rögtön telítődik a folyadékkal és így hosszú fonalak formájában kicsapódik. A fonalakat a forgó tekercselővel mozgásban tartjuk, amelyek a tartóedényben lévő folyadékot is megforgatják. A fel nem oldott nátrium-hialuronát kicsapódott fonalai a tekercselő „ujjaival’' vagy függőleges pálcáival érintkezve megtapadnak azon. Miután a termék hajlamos arra, hogy önmagával vagy a legtöbb felületen megtapadjon, összegyűlik a tekercselőn. Feltehető, hogy ez a tapadás hosszabb polimereket eredményez, amelyekben számos hidrogén-híd alakul ki az egyes csoportok között, amely önmagában is a nagyobb móltömeg és a nagyobb viszkozitás irányába hat. Ha az alján keresztül üríthető tartóedényt alkalmazunk, lehetővé válik, hogy a hígított folyadékot a tartóedényből eltávolítsuk és kívánság szerint vizes vagy puíferolt oldatot vezessünk be. A kicsapódott termék ily módon a tertóedényben újabb kezelés nélkül ismét oldhatóvá tehető. Megjegyezzük, hogy a 4 517 795. számú USA-beli szabadalmi leírásban adott kitanítás a fenti munkamódszertől teljes mértékben eltér. A 4 517 795. számú USA-beli szabadalmi leírásban ugyanis többször hangsúlyozzák, hogy az etanol-HA oldatot nem keverik. A hőkezelés módja: Az 1—3. táblázatok mutatják a hő hatását a viszkozitásra. A viszkozitásadatokat Cannon - Manning - Semimikroviskosimeters - rel mértük az ASTM D445 és D2515 előírásai szerint 37°C hőmérsékleten. A móltömeget gélszüréssel (Heftmann, kromatográfia) határoztuk meg Fast Protein Liquid Chromatograph (FPLC) segítségével TSK HW 65F vagy TSK HW 75F oszlopon az alábbi munkamódszerrel: Tömegáttag meghatározása a nátrium-hialuronát móltömegéhez (Mw) 1.0 Cél Olyan folyadékkromatográfiás módszert kell kidolgozni, amely lehetővé teszi a nátrium-hialuronát molekula átlagos tömegének meg3 határozását ismert standard móltömeg átlagértékekhez viszonyítva. 2.0 Tartomány Felhasználható bármely nátrium-hialuronát nyersanyaghoz és/vagy késztermék mintához. 3.0 Elvek Gélszűrés (méret szerinti kizárásos kromatográfia) segítségévei az analit-cSúcs-elúciós térfogat és a hasonló molekulaszerkezetű és sűrűségű, de ismert átlagos móltömegű anyag analízisével felvett standard görbe öszszehasonlításával információt nyerünk a móltömegről. A standard görbét olyan molekulamérettartományban kell felvenni, amelybe beleesik a vizsgált minta mérete. 4.0 Munkamódszer 4.1 Készülék paramétere Oszlop: Fractogél TSK HW 65 F (EM Sciences) frakcionálási tartomány == — 50.000—5.000.000 móltömeg (globuláris faj) Oszlopméret: 50 cm;fc2 cm x 2,01 cm belső átmérőjű gélágy. Mozgó fázis: PBS-P, 0,22 pm PTEE-n szűrve (150 ml/injekció). Áramlási sebesség: 2 ml/pere. Papírsebesség: 0,20 cm/perc. Detektorérzékenység: 4 x 0,05 (ISCO VY). Hullámhossz: 205—208 nm. Irányítóberendezés: LCC 500 (Pharmacia), a megadott paraméterű oszlop üzemelésére programozva. Injektált térfogat: 1000 pl. Hőmérséklet: Az oszlopot állandó hőmérsékleten kell tartani, amelynek során a szobahőmérséklet a legelőnyösebb. A hőmérséklet változása megzavarja az alapvonalat, és csak azonos hőmérsékleten elvégzett vizsgálatokat lehet fenntartás nélkül összehasonlítani. Az oszlopot a mozgó fázissal állandó alapvonal kialakulásáig hagyjuk stabilizálódni. 4.2 Standard görbe felállítása 4.2. a Reagensek Mozgó fázis: Tireoglobulin (Sigma # T— 1001) M®=669 000 vagy ezzel ekvivalens, valamint kék dextrán 4.2. b Standardok 0,006 g anyag 25 ml mérőlombikba tarténő bemérésével tireoglobulin törzsoldatot készítünk. Az anyagot a mozgó fázissal jelig töltjük. Teljes oldódás után az elegyet időnként felrázzuk. 10 ml törzsoldatot 20 ml mérőlombikban pipettáink. Ezután a mozgó fázissal jelig töltjük. A kapott oldat 125 pg/ml tireoglobulint tartalmaz. 4.2 c 0,08 g anyag 20 ml merőlombikba történő bemérésével kék dextrán (Blue Dextran) törzsoldatot készítünk. A mozgó fázissal jelig töltjük. Teljes oldódás után az elegyet időnként felrázzuk. 5 ml törzsoldatot 20 ml mérő-4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
