197928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadorelin és gonadorelin-analóg hormonszintézis peptid köztitermékének racemátszegény előállítására
197928 3. példa Z-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-OBut előállítása PPA eljárással 58,9 g (0,1 mól) Z-Trp-Ser-Tyr-OH-t és 41.7 g (0,1 mól) H-Gly-Leu-OBut • Tos-OH-t 400 ml diklór-metilénben oldunk és az oldatot 0—|-5°C-ra hütjük. Ezután az oldathoz hűtés közben kb. 20—30 perc alatt egyidejűleg két csöpögtetőtölcsérből hozzácsöpögtetünk 96,5 ml N-etil-morfoiint és 96,5 ml n-propil-foszfonsavanhidridet 50 tömeg%-os metilén-kloridos oldat formájában. Ezután a reakcióelegyet szobahőmérsékletre melegítjük, majd 3—20 óra elteltével 2X150 ml 5%os nátrium-karbonát-oldattal, 150 ml 13%os nátrium-klorid-oldattal, 150 ml 10%-os kálium-hidrogén-szulfát-oldattal és 5%-os nátrium-klorid-oldattal extraháljuk. A metilén-kloridos fázist vákuumban bepároljuk, majd a visszamaradó anyagot etil-acetát, ligroin elegyből kristályosítjuk. A kristályokat kiszűrjük és 100 ml ligroinnal mossuk, majd vákuumban szárítjuk. Ily módon 86%-os hozammal 70 g cím szerinti terméket nyerünk. [a]22=—25,8° (c=l, metanol). 1. referenciapélda Z-Trp-Ser-Tyr-N3 előállítása 6 g (10 mmól) Z-Trp-Ser-Tyr-N2H3-t 40 ml DMF-ban oldunk, az oldatot —30°C-ra hütjük, majd kb. 20 perc alatt hozzáfolyatunk 52,5 ml (42 mmól) 8n dioxános hidrogén-klorid-oldatot, majd —20°C hőmérsékleten újabb 20 perc alatt 1,4 ml t-butil-nitritet adunk hozzá 12 ml dioxánban oldva. Az elegyet ezután —20°C-on 20 percig keverjük, —30°C-ra hűtjük és 5,3 ml N-etil-morfolinnal reagáltatjuk. A hideg oldatot 650 ml hideg dieti 1 - -éterbe visszük és a kiváló csapadékot a felülúszótól dekantálással különítjük el, majd ismét hideg éterrel keverjük és dekantáljuk. A visszamaradó anyagot 40 ml metilén-kloridban vesszük fel, háromszor kb. 25 g jeges vízzel extraháljuk, és az oldatot nátrium-szulfáton szárítjuk. Az így kapott oldatot az IR-spektrum felvétele alatt hűtőszekrényben őrizzük. A friss oldat ÍR spektrumában 4.7 pm-nél éles sávot észlelünk, körülbelül 1 óra eltelte után 4,5 pm-nél egy új jelet kapunk, amely 24 óra elteltével már nagyobb, mint az eredeti, 4,7 pm-nél észlelt sáv Schwyzer és mtársai [Helv. chim. Acta, 44, (1961) 1991] szerint ez a megfigyelés savazidnak a megfelelő izocianáttá való Curtius-féle átalakulásával magyarázható. 2 2. referenciapélda Tárolt azid-oldat reagáltatása H-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-N H Et • 2Tos-OH-val A 4.1. példa szerint előállított oldatot 1 napon át hűtőszekrény hőmérsékleten tároljuk, majd 5 g (5,6 mmól) H-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt-2Tos-OH 15 ml DMF- ban készült oldatával és I ml N-etil-morfolinnal reagáltatjuk, majd ismét -|-50C-on tároljuk éjszakán át. A terméket az 1.6. példá-11 ban ismertetett feldolgozási eljárás szerint elkülönítjük, majd metanolos oldatban aktívszénhordozós palldiumkatalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A hidrogénezés után kapott reakcióterméket nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással vizsgáljuk. A vizsgálatot nukleozilR 5SA oszlopon (4X X300 mm), 40% 1%-os, pH^ö.S-as kálium-dihidrogén-foszfát puffer, 60% acetonitril elegy futtatószer alkalmazásával végezzük. Az áramlási sebesség 1 ml/perc, detektor: UV, 220 nm. Azt találtuk, hogy a körülbelül 25 perc retenciós idejű főtermék a H-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt mellett egy kevésbé intenzív, körülbelül 30 perces retenciós idejű melléktermék is jelentkezik. Az 1.1 —1.6 példák szerint előállított termék összehasonlító vizsgálatával azt találtuk, hogy csak az 1.6 példa szerint előállított termék tartalmaz 30 perc retenciós idejű melléktermék csúcsot, a melléktermék menynyisége a csúcs alatti területnek körülbelül 15%-a, míg a találmány szerinti eljárással előállított termékek nem tartalmaznak mellékterméket. Nyilvánvalónak tűnik, hogy a nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárás során 30 perces retenciós idővel jelentkező melléktermék egy karbamidszármazék, amely az azidból Curtius-féle átalakulással a 4.1 példában képződött izoc-ianát további átalakulásának terméke. 3. referenciapélda Z-Ser-Tyr-ONb előállítása 4 literes négynyakú lombikban szobahőmérsékleten 1,8 1 dimetil-formamidban 244,0 g tirozin-p-nitro-benzil-észter-toluolszulfonátot és 119,6 g benzil-oxi-karbonil-szerint oldunk, majd az oldatot 0—|-5°C közötti hőmérsékletre hűtjük. Az elegyhez kb. 5°C hőmérsékleten 300,0 ml N-etil-morfoiint adunk, majd 20 perc alatt 275,0 liter propán-foszfonsavnahidrid/metilén-klorid-oldat elegyét csepeghetjük hozzá. Ezután a reakcióelegy hőmérsékletét 1/2 óra alatt szobahőmérsékletre emeljük. Körülbelül 4 óra elteltével megkezdjük a DMFs ledesztillálását vákuumban. A desztilláláshoz rotációs bepárlót használunk. A desztiIlátás befejezése után a visszamaradó anyagot etil-acetátban oldjuk és vízzel éles oldattá keverjük. A vizes fázis pH-értéke kb. 6 körüli. Az etil-acetátos fázist választótölcsérrel elválasztjuk, a vizes fázist ismét etil - acetáttal elkeverjük, majd a két szerves fázist egyesítjük és a visszamaradó vizes fázist DC eljárással történő ellenőrzést követően elöntjük. A szerves fázist kálium-hid rogén-s7ulfát oldattal, nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vízzel extraháljuk. Az etil-acetátos oldatot vákuumban szárazra pároljuk, a visszamaradó olajos anyagot dietil-éterrel elegyítjük, miközben az olaj kristályos anyaggá alakul. A kapott kristályokat kiszűrjük és vákuumban szárítjuk. Ily módon 12 7 5 70 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
