197773. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-vinil-penam származékok előállítására
197773 tegkromatográfiával választhatjuk el, eluensként etil-acetát:hexán = 4:6 térfogatarányú elegyét használva, majd szintén etil-acetát és hexán elegyéből kristályosíthatjuk a homogenitás érdekében. Op.: 116—118°C. IR(CHC13); gammaffl„ : 1730 s (C02), 1700 s (C02), 1508 m, 1378m, 1205w. NMR (300 MHz, C2HC13): delta 1,00 (3H, d, J = 6Hz, CHCH3); 1,61 — 1,92 (4H, m, CH2-CH2-CH2CO); l, 07—1,25 (3H, m, CH2-CO, CHCH3); 2,58—2,88 (2H, m, CH2S); 3,75 (2H, s, SCH2C6H5 4,36 — 4,48 (2H, m, 2x xNHCHCO); 4,57—4,63 (1H, m, NHCHCO); 4,99—5,21 (8H, m, 3xOCH2C6H5, C= =CH2); 5,56—5,75 (2H, m, CH=CH2, NH); 6,35 (1H, d, J = 8Hz, NH); 6,91 (1H, d, J =8,5 Hz, NH); 7,31—7,37 (20H, m, aril H). MS (térdeszorpciós): m/e 779 (M+). A szeparált vegyület szerkezetét igazolta az is, hogy benzolban, [(C6H5)3P]3RhCl alkalmazásával hidrogénnel 105 Pa nyomáson 1 óra hosszat redukálva, a megfelelő, J.E. Baldwin és munkatársai által a J.Chem.Soc., Chem. Commun., 1984, 1167, folyóirat közleményében és az abban hivatkozott referenciákban leírt allo-izoleucinil-tripeptid keletkezik. D. A címbeli tripeptid védőcsoportjának eltávolítása A címbeli tripeptid előállítása érdekében a C. pontban előállított N-CBz S-benzil védőcsoportokkal ellátott tripeptid-dibenzil-észter védőcsoportjait cseppfolyós ammóniában nátriummal távolítottuk el J.E. Baldwin és munkatársai által a J.Chem., Soc., Perkin 1, 1981, 2253 folyóiratban közölt körülmények között. A védőcsoportoktól megfosztott tripeptidet ezután híg ammónium-hidroxidban (pH = 8) oxidáljuk a megfelelő diszulfid származékká, az oldaton 2 órán át oxigéngázt átvezetve. A diszulfidot ezután preparatív elektroforézissel tisztítjuk (pH 3,5, 4 kV, 80 perc) az anódot 5—10 cm-re megközelítő ninhidrinre aktív sáv extrakciójával. A tisztított diszulfidot 77%-os kitermeléssel kaptuk meg. NMR (300 MHz, D20,_HOD = 4,63 ppm); delta 0,87 (3H, d, J = 5,5 Hz, CHCH3); 1,51 — 1,74 (4H, m, CH2-CHXH2CO); 2,08—2,26 (2H, m, CH2CO); 2,55—2,57 (1H, m, CHCH3); 2,77—3,03 (2H, m, CH2S); 3,47—3,58 (1H, m, NHCHCO); 4,14 (1H, d, J = 5,5 Hz, NHCHCO); 4,91—4,96 (2H, m, C=CH2); 5,60—5,67 (1H, m, CH=CH2) MS (pozitív argon FAB, ditio-treitol jelenlétében m/e 376 (MH+, 12%). 5 2. példa 6ß-(L-a-amino-adipoil)-2ß-metil-2a-vinil-penam-3-karbonsav Az 1. példában leírt eljárást követve előállított ő- (L-a-amino-adipoil) -L-ciszteinil-D-gamma, delta-didehidro-izoleucin diszulfid 28 mM-jának (0,100 ml) vizes oldatát 100 mM (0,100 ml) ditiotreitol, 50 mM (0,100 ml) L-aszkorbinsav, 5 mM (0,100 ml) vas(II)-szulfát, 10.000 egység/ml (0,050 ml) ökörmáj kataláz és 50 mM (3,5 ml) ammónium-hidrogénkarbonát vizes oldatával elegyítjük. Az elegy pH-ját folyamatosan figyeljük, és, ha szükséges, híg nátrium-hidroxid (100 mM) hozzáadásávál pH = 8-ra állítjuk be. 27°C-on 5 percig rázatjuk és Cephalosporium acremonium-'ból (5 NE/ml; 1 ml) izolált izopenicil 1 in N-szintetáz készítményt adunk hozzá 50 mM-os ammónium-karbonát oldatban. Az inkubációs elegyet két 10 ml-es edényben 27°C-on 45 percig rázatjuk, majd 7 ml aceton hozzáadásával a fehérjét kicsapva a reakciót leállítjuk. A csapadékot centrifugálással elválasztjuk. A felülúszót az aceton eltávolítása érdekében vákuumban bepároljuk és a maradék kifagyasztásával a (B) képlettel jellemzett 2a-vinil-penam ikerionos formáját nyerjük nyers állapotban. A nyersterméket fordított fázisú oktadecil-szilán alapú HPLC-vel tisztítjuk (250x4,6 mm -es oszlop, 10 mmól-os ammónium-hidrogénkarbonát mozgó fázis, 1 ml/perc áramlási sebesség alkalmazásával), a retenciós idő: 7— 8 perc. NMR (500 MHz, D20, 3-trímetil-szilí 1 -propionát [2,2,3,3-2H4] TSP = 0,00 ppm): delta 1,53—1,77 (4H, m, CH2-CH2- -CH2CO); 1,59 (3H, s, 3ß-CH3); 2,25—2,38 (2H, m, CH2CO); 3,56—3,59 (1H, m, CH(CH2)3); 4,18 (1H, s,2-H) 5,03 (1H, d, J = 10,5 Hz, CH=CH2); 5,22 (1H, d, J = = 17 Hz, CH=CH2); 5,35— 5,45 (2H, ABq, J = 4 Hz, 5,6- -H); 5,91 (lH.dd, J = 10,5 Hz és 17 Hz, CH=CH2). A 2ß-metil-csoport asszignációja NOÉ (Nuclear Overhauser Effect) mérésekből következik. Ugyanis a 2ß-CH3 csoport besugárzása delta H= 1,59-nél a 2-H 12%-os megnövekedését eredményezte, nem az 5-H jelét, míg a CHy=CH2 proton besugárzása delta H= = 5,91-nél az 5-H proton jelének 3%-os növekedéséhez vezetett. MS (pozitív argon FAB (fast atom bombardment = gyorsatom bombázás), m/e 372 (MH+). Felhasználási példák 3. példa 6ß-amino-2a-vinii-2ß-metil-penam-3-karbonsav 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
