197767. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozása és jellemzésese, valamint humán H2 relaxin előállítására
197767 gos vizsgálati mintákat alkalmazva nem tuddunk észlelni semmiféle átírási (transzkripciós) terméket a Hl génből, bár egészen alacsony szintű kifejeződést (a H2 szint kevesebb, mint 5%-a) nehéz is lenne azonosítani. Abból a célból, hogy a H2 génből származó különböző mRNS átiratokat elemezzük, a kódoló területnek és az 5’ és 3’ le nem fordított területeknek megfelelő két nagy H2 cDNS klón szegmenseiből fajlagos vizsgálati mintát készítünk (4. ábra). A nagyobb mRNS átirat) niintegy 2 kb hosszúságú) szelektíven hibridizálódik mindkét cDNS kiónból származó 3’ le nem fordított terület szegmenseihez, mintegy 100 bázisra a befejező kodontól. Egy potenciális poliadenilációs szignál van a cDNS klón nukleotid szekvenciájában, 140 bázisra a befejező kodontól, és ez a terület nem homológ a sertés relaxin poliadenilációs helyével. A kérdés azonban, vajon a rövidebb mRNS termék poliadenilált-e ennek a helynek a közelében, nem oldható meg addig, amíg mindkét mRNS formának megfelelő teljes hosszúságú cDNS nincs izolálva és jellemezve. A H2 gén genom-szekvenciájának hijján lehetetlen meghatározni a két mRNS átirat képződésének mechanizmusát. Lehetséges viszont, a kollagén és a ß-mikroglobulin génekhez hasonlóan, hogy a primer RNS átírat hasítása egy másik poliadenilációs helynél történik. Másrészt viszont nem zárhatjuk ki egy alternatív illesztési mechanizmus lehetőségét sem, amint ez elő is fordul a kalcitonin növekedési hormon- és a-krisztallin-géneknél. A H2 gén által kódolt preprorelaxin primer szerkezete A humán preprorelaxin gének in vivo termelésének módja még nem teljesen érthető és csak a sertés és patkány preprorelaxinok termelésének analógiája alapján lehet erre visszakövetkeztetni (5. ábra). A Hl és H2 gének megjósolt B és A lánc szerkezeteit sorakoztathatjuk fel más relaxin-fajták és a humán inzulin szerkezete mellett az 5. ábrában. A Hl-ben levő szignál peptid hasításáról az várható (Hudson és munkatársai korábban idézett munkája, 1983), hogy egy rövid oldallánc-maradék után mint pl. Alá-1, ~2 vagy ~3 után vagy Ser-6 után történik meg. Az Ála~' utáni hasítás egybevág a sertés preprorelaxin és a humán preproinzulin homológiájával. Hasonlóképpen a H2 szignál peptid' hasítása hasonló analógiával az Alá-2 után történik meg, bár az Alá”4 vagy Ser-6 utáni hasítások is további lehetőségek. A patkány és a sertés prorelaxinok analógiájára a hasítás a B lánc/C peptid kapcsolódásnál a Leu32 után történik mind a Hl, mind a H2 prekurzorokban. Mindkét humán relaxin B lánc azonban a 29—30. helynél a megőrzött Lys-Arg kéttagú szekvenciával rendelkezik, amely ismert műveleti hely más prohormonokban, mint pl. proinzulinban, és a hasítást itt sem lehet kizárni. A terhesség sárgatestből izolált relaxin közvetlen aminosav-szek- 10 17 vencia analízise szükséges ennek a pontnak a megoldásához. Jelenleg úgy tűnik, hogy a Hl B lánc legvalószínűbb szerkezete 32 gyök hosszúságú (Lys1—Leu32) és a H2 B lánc 33 gyök hosszúságú (Asp-1—Leu32). A H2 gén biológiai aktivitása Amint a szintetikus sertés relaxin peptidekkel foglalkozó korábbi tanulmányainkban kimutattuk, vannak a sertés B és A láncban olyan lényeges belső szekvenciák, amelyek a biológiai aktivitás összes lényeges elemét tartalmazzák. A Hl relaxin-peptidek szintézisekor úgy találtuk, hogy a teljes Hl A lánc (Arg137—Cys160) kombinálása a Hl B lánc rövidített formájához (Lys1—Ser25) olyan anyagot termel, amelynek van biológiai aktivitása (Hudson és munkatársai, korábban idézett munka, 1983). Mind a Hl, mind a H2 gén szerkezetekre vonatkozó, peptid-szintézist alkalmazó tanulmányaink azt tárták fel, hogy mindkét gén relaxin-formájú vegyületeket kódol, amelyek biológiailag aktivak a patkány méh összehúzodási vizsgálatokban. Egy módosított humán relaxin H2 (hRLX)A(1—24)-B(-l—24) szintézise 1.) A humán relaxin A-lánc, H2 hRLX A(l — 24) szintézise A humán relaxin A-lánc 1—24 gyökeinek megfelelő aminosav szekvenciáját, amelyet a fentiekben leírt módon a genom klón nukleotid szekvenciájából következtettünk ki, szilárd fázisú módszerrel szintetizáljuk, a Merrifield által leírt általános elvek szerint (pl. Bárány, G. és Merrifield, R.B.: „The Peptides" 1—284 oldal, szerkezetté E. Gross és J. Meienhofer, Academic Press kiadás, New York). N-a-tercier-butil-oxi-karbonil (a továbbiakban „BOC") -4-metil-benzil-L-ciszteint 0,30 mmól/g mennyiségben véve kapcsolunk egy 1% keresztkötéssel ellátott polisztirol gyantára, fenil-acetamido-metil (PAM) kötéssel, Tam és munkatársainak módszere szerint (Synthesis 12, 955—957 (1979)). A BOC-L-CYS-PAM gyantát (8,0 g) egy Beckman 990 Modell-típusú peptid-szintetizáló edénybe visszük át és az aminosav-szekvenciát a 23. gyöktől az 1.-ig elkészítjük az egyes megfelelően védett aminosavak lépésenként beadagolásával. Az egyes aminosavak amino-végéről a BOC csoportot olyan- módon távol ítjuk el, hogy a gyantát 30 percen át 35%-os metilénkloridot trifluor-ecetsav oldattal kezeljük, majd semlegesítjük 15 percen át 5%-os metilén-kloridos diizopropil-etil-amin oldattal. A gyantát minden kezelés után alaposan átmossuk metilén-kloriddal. A szekvenciában következő aminosavat (amelynek az a-amino-csoportja BOC csoporttal, és ahol szükséges, az oldalláncok funkciós csoportjai is megfelelően védettek) összekapcsoljuk a gyantával, diciklohexil-karbodiimidet (DCC) alkalmazva. A gyantát és az aminosavat keverjük metilén-kloridban 10 percen át, mielőtt a DCC-t adagoljuk, amelyet szintén metilén-kloridban 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
