197767. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozása és jellemzésese, valamint humán H2 relaxin előállítására
oldunk. 2,5-szörös moláris aminosav- és DCC felesleget (6,0 mmól) használunk minden egyes kötéshez. 1 órás keverés után a gyantából mintát vesszünk és megvizsgáljuk szabad aminosavakra, Kaiser és munkatársai ninhidrines módszerét alkalmazva (Anal. Biochem., 34, 595—598 (1970)). Ha a ninhidrines vizsgálat negatív, ez jelzi, hogy a kapcsolat teljes, és a reakció-ciklus folytatódhat a következő aminosav BOC védőcsoport eltávolításával, semlegesítésével és kapcsolásával. Pozítiv ninhidrin reakció esetén a kapcsolási reakciót meg kell ismételni további aminosavval és DCC-vel. Az oldalláncban funkciós csoportokkal rendelkező aminosavak közül a következő védett termékeket alkalmazzuk: N-a-BOC-2,6-diklór-benzil-L-tirozin; N-a-BOC-3-klór-benzil-oxi-karbon il-L-lizin; N-a-BOC-L-szerin-O-benzil-észter;. N-a-amil-oxi-karbonil-N -tozil-L-arginin N-a-BOC-L-treonin-O-benzil-észter N-a-BOC-S-etil-merkapto-L-cisztein (az A lánc 15., 11. és 10 szekvencia helyén levő ciszteinekhez) Az 1—24 peptid szekvencia elkészítését követően a végső BOC csoportot az amin-terminálison levő argininről eltávolítjuk, a védőcsoport-eltávolító semleges ciklust használva, majd a pepiidet tartalmazó gyantát (13 g) vákuumban szárítjuk. A pepiidet tartalmazó gyanta egy részét (2 g) vízmentes hidrogén-fluoriddal kezeljük anizol (2 ml) jelenlétében 0°C hőmérsékleten 30 percen át. A pepiidet tartalmazó gyanta hidrogén-fluoriddal történő teljes érintkezési idejét a minimumon kell tartani (ne legyen több, mint 70 perc) a HF-ot olajszivattyús vákuum segítségével gyorsan eltávolítjuk. A peptidet tartalmazógyantát azután többször átmossuk etil-acetáttal az anizol eltávolítása érdekében, majd a peptidet I mól/literes ecetsavval extraháljuk, és az oldatot liofilezzük. A nyers peptid kezdeti tisztítása gélszüréssel történik Biogel P 10-en, 0,1 mól/literes ecetsavban. Erről az oszlopról a fő csúcsot reprezentáló frakciókat, amelyeket a kb. 3000 molekulasúlynak megfelelő helynél eluálunk, összegyűjtjük és liofilezzük. Ennek a pepiidnek az aminosav-elemzése jelzi, hogy az 1—24 szekvencia öszszes aminosavai a helyes arányban vannak jelen. Az [S-tioettl-Cys10’11’15] -hRLXA( 1 —24) peptid további tisztítását preparatív fordított fázisú HPLC-vel (nagy felbontású folyadékkromatográíia) végezzük, Waters C-18 Bondapak oszlopon, 0,1% trifluorecetsav (TFA)- (víz) acetonitril oldószer-rendszert alkalmazva. A gélszűréssel tisztított peptid egy 80 mgos mintáját S-szulfonáljuk nátrium-szulfit és nátrium-tetrationát keverékével (teljes reakcióidő: 3 óra) Du és munkatársainak módszerével (Scientia Sinica, 101,84—104 (1961) 19 Az S-szulfonálás folyamán képződött csapadékot szűréssel elkülönítjük, és mind a csapadékot, mind a felüluszó oldatot dializáljuk vízzel szemben 4°C hőmérsékleten 4 órán át. A dializáló cső tartalmát liofilezzük, így a felülúszó oldatból 39,5 mg, míg az S-szulfonálási reakció során keletkezett csapadékból 20,3 mg peptidet nyerünk. Az „oldható" [S-szulfo Cys,0’u’15’2ÍhRLX] A( 1—24) peptid egy mintáját preparatív fordított fázisú HPLC vei tisztítjuk Waters C-18 Bondapak oszlopon, 0,1% TFA-víz/acetonitril oldószer-rendszert használva. A rövidített humán relaxin B-lánc (H2 hRLX B/-1 — 24) szintézise A H2 humán relaxin B lánc -1-24 gyökeinek megfelelő aminosav szekvenciát a fentebb leírt eljárással szintetizáljuk, 6,0 g N-a-tercier-butii-oxi-karbonil-L-metionin-O-benzil-L-szerin-fenil-acetil-amino-metil polisztirol gyantával kezdve, 0,5 mmól Met/g terheléssel. Ugyanazokat az oldallánc-védő csoportokat használjuk a B lánchoz, mint amelyeket az A láncnál alkalmaztunk, beleértve a cisztein S-etil származékokat is a 10. és 22. helyeken. A 4. és 5. helyeken levő glutaminsav gyököket és a -1. helyen levő aszparaginsav-gyököt N-a-BOC-benzil-észter származékokként adagoljuk. A glutamint a 18. helyen aktív észteres eljárással kapcsoljuk, N-a-BOC-L-glutamin-p-nitrofenil-észtert használva dimetil-formamidban. A 2. helyen levő triptofán kapcsolása után 0,1% indolt adunk a trifluorecetsav védőcsoport-eltávolító reagenshez és az ezt követő metilén-kloridos mosófolyadékhoz. A peptidet tartalmazó gyanta végső súlya 8,5 g, mintán a BOC csoportot az amin-terminális aszparaginsav-gyökéről eltávolítottuk, és vákuum-szárítást végeztünk. A peptidet tartalmazó gyanta egy részletét (3,5 g) vízmentes hidrogénfluoriddal kezeljük 2 ml anizol jelenlétében 0°C hőmérsékleten 30 percen át és a B peptid láncot izoláljuk az A láncnál korábban leírt módszer szerint. A nyers [S-tioetil-Cys10’22] hRLXB (-1 -24) -et (0,97 g) gél-szűréssel tisztítjuk Bie-Gel P10-en 1 mól/literes ecetsav-oldattal, majd preparatív HPLC- vel. A gél-szűréssel tisztított peptid egy 100 mgos mintáját S-szulfonáljuk 8,3 pH-nál 3 órán át, a reakciókeveréket szűrjük, és mind a csapadékot, mind a felülúszó-oldatot dializáljuk desztillált vízzel szemben. Az „oldható" peptid mennyisége liofilezés után 42,4 mg, az „oldhatatlan" peptidé 59,5 mg. Az S-szulfonált B-peptid láncokat tovább tisztítjuk preparatív HPLC-vel, C 18 fordított fázisú oszlopot és 0,1% TFA-víz/acetonitril rendszert alkalmazva. 3.) Lánc-kombináció A szintetikus H2 hRLX A(1—24) és H2 hRLX B (-1—24) peptídeket azzal a módszer20 11 197767 5 10 15 2C 25 3C 35 40 45 50 55 60 65
