197767. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozása és jellemzésese, valamint humán H2 relaxin előállítására
197767 és/vagy helyettesítve van olyan kodonnal, amely más aminosavat kódol, mint amilyent természetes kodon kódol és/vagy további kodonok vannak hozzáadva a természetes szekvenciákhoz. A találmány szerinti transzfer vektorok magukban foglalhatnak többek között olyan genetikai információkat is, amelyek biztosítják azok replikációját, amikor átkerülnek egy gazdasejtbe. Ilyen sejtek lehetnek pl. prokarióta mikroorganizmus sejtek, mint pl. baktériumok, élesztők és gombák, valamint eukarióta sejtek, beleértve az emlős sejteket és sejtvonalakat is. A baktérium-genetikában leginkább használt transzfer vektorra jó példa a plazmid és bizonyos bakteriofágok DNS-ei. Mind a fág DNS-t, mind a bakteriális plazmidokat használjuk transzfer vektorként a jelen munkában. Meg kell érteni azonban, hogy más típusú transzfer vektorokat is lehet alkalmazni. Az ilyen transzfer vektorok képzésének és a mikroorganizmusba transzformálásának általános technikája jól ismert a szakirodalomban. A találmány magában foglalja azokat a prokarióta vagy eukarióta sejteket is, amelyek a fentebb leírt transzfer vektorok bármelyikével transzformálva vannak. Egy előnyös mikroorganizmus a jól ismert Escherichia coli, de bármilyen más alkalmas mikroorganizmust is lehet használni. A jelen találmány egy még további tárgya eljárás egy DNS transzfer vektor előállítására, amely vektort a humán preprorelaxint kódoló dezoxinukleotid szekvenciák replikálásában és fenntartásában alkalmazunk, és amelyre az jellemző, hogy egy humán preprorelaxint kódoló dezoxinukleotid szekvenciának és egy restrikciós enzimes hasítással készített DNS mulekulának összekapcsolásával készül. A humán prorelaxint, valamint a humán relaxint A és B láncait kódoló dezoxinukleotid-szekvenciák replikálására és fenntartására alkalmas DNS transzfer vektorokat hasonlóképpen készíthetjük el a megfelelő dezoxinukleotidokból. Az A és B peptid láncokat, valamint a proprerelaxint és preprorelaxint a gén-kifejeződés szokásos módszereivel készíthetjük el, azaz a megfelelően transzformált transzfer vektort tartalmazó sejt növesztésével és a sejt által termelt kívánt peptid(ek) kinyerésével és tisztításával. így a találmány magában foglalja azt az eljárást is, amelyben egy kapcsolt fehérjét állítunk elő, amely a humán preprorelaxin aminosav-szekvenciáját tartalmazza, mint C-terminális szekvenciát és a prokarióta vagy eukarióta fehérje egy részét, mint N-terminális szekvenciát; az eljárást az jellemzi, hogy egy humán preprorelaxint kódoló dezoxinukleotid szekvenciát tartalmazó kifejeződni képes transzfer vektorral transzformált sejt 9 6 tenyésztetét inkubáljuk, mindezekben a műveletekben a fentebb leírt eljárást követve. A humán relaxin A és B láncainak, valamint a humán prorelaxinnak aminosav-szekvenciát tartalmazó kapcsolt fehérjéket hasonló módon lehet előállítani. Az így előállított kapcsolt peptid termék egy olyan kapcsolt fehérje formájában van jelen, amelyben a kívánt peptid kapcsolva van a gazdasejtre jellemző prokarióta vagy eukarióta fehérje egy részletével. Az ilyen fehérjék szintén részei ennek a találmánynak. A találmány magában foglalja az egymástól C pepiiddel elválasztott A és B pepiidet tartalmazó humán -prorelaxint szintetizáló eljárást, az eljárás azzal jellemezhető, hogy az említett emberi prorelaxint kódoló, a fentebb jellemzett eljárással előállított dezoxinukleotid szekvenciát tartalmazó, kifejeződni képes transzfer vektorral transzformált sejtek tenyészetét inkubáljuk az említett humán prorelaxint kódoló szekvencia kifejeződéséhez ajkalmas körülmények között, és az említett sejtek tenyészlevéből vagy lizátumából a humán prorelaxint megtisztítjuk. A számunkra érdekes pepiidet a kapcsolt termékből bármilyen alkalmas, ismert hasítási eljárással ki lehet nyerni. Amint ezt már fentebb jeleztük, a transzfer vektort lehet módosítani kodon helyettesítéssel, törléssel (delécióval) és hozzáadásával, és az ilyen módosítások módosított kapcsolt peptidekhez vezethetnek- Ilyen módon megfelelő módosításokkal el lehet érni a kapcsolt peptidek hasításának megkönnyítését, pl. a B/C vagy C/A láncok kapcsolódásánál, vagy a peptid lánc viselkedésének módosítását a rá következő kémiai vagy biológiai műveleteknél. Amint fentebb jeleztük, a találmány szerinti módszerrel elő lehet állítani humán relaxint, prorelaxint és preprorelaxint. A relaxint az egyedi A és B láncok közvetlen kombinációjával elő lehet állítani, bármely az inzulin készítésénél jelenleg ismeretes és alkalmazott módszerrel. Az inzulinhoz hasonló módon relaxint lehet készíteni prorelaxinból oxidációval vagy bármilyen módszerrel, amely a relaxin fentebb ismertetett módszerekkel előállított A és B peptidjeinek merkapto-csoportjait diszulfid keresztkötéssé alakítja az A és B peptidek között, majd a C peptid lehasításával, pl. enzim-katalizált hidrolízissel, amely fajlagos a C pepiidet az A és B peptidekkel összekötő kötésekre. Következésképpen a jelen találmány humán relaxin szintéziséhez olyan módszert szolgáltat, amely a teljes hosszúságú, rövidített vagy módosított formájú relaxin A és B láncainak kombinálásából áll; a módszer a humán inzulin esetében az A és B láncok kombinációjánál önmagában ismeretes. Egy ilyen módszer az S-szulfonált A és B láncok keverékének redukciójából, majd a ke10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
