197767. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozása és jellemzésese, valamint humán H2 relaxin előállítására
197767 veréknek oxidáció céljából levegőn tartásából áll. Ügy találtuk, hogy a fenti eljárás hatásossága javul, ha az A és B láncok egyike vagy mindkettő S-tioetil-cisztein származék formájában van jelen S-szulfo forma helyett. Az általunk benyújtott 15413/83 (PF 4385/82) számú ausztrál szabadalmi bejelentésben bemutattuk, hogy a relaxin A és B láncok egyikét vagy mindkettőt le lehet rövidíteni az amino- vagy karboxi-végnél anélkül, hogy a biológiai aktivitás jelentősen csökkenne, ugyanakkor a kombináció kitermelése nő. Ezek a technikák ugyanúgy használhatók a humán relaxin előállításához. A találmány egy még további tárgya egy olyan humán relaxinanalóg előállítása, amely lényegében a természetes B és/vagy A peptid láncok rövidített vagy módosított formáit tartalmazza. Ez az eljárás a B és/vagy A láncok rövidített vagy módosított formájának kialakítási lépéséből és azok bármely fentebb említett módszerrel történő összekapcsolásából áll. Vizsgálataink mind sertés, mind humán (Hl) relaxinnal megmutatták, hogy a relaxin-aktivitás még jelen lehet az A láncnál az A (10—24) lerövidítéséig és a B láncnál a B (10—22) lerövidítésig, bár a várható gyakorlati minimum A (4—24), illetve B (4—23). Általában az A lánc variálható A (1—24)től A (10—24)-ig és a B lánc B (1—32)-tői B (10—22) -ig. Az előnyös kombinációk a következő öszszeá11 ításokból származnak: A B (1—24) (1—23)-tói az (2—24) bármelyike a (I—32)-ig terjedő (3—24) peptidek bármelyikével. A B és/vagy A láncok módosítása a jelen találmánnyal összhangban magában Foglalhat „genetikai" módosítást, amint ezt a fentiekben leírtuk, vagy a B és/vagy A láncok kémiai módosítását (vagy teljes hosszban, vagy rövidített formában) a találmány szerinti módszerrel történő kombináció előtt. Két típusú módosítást alkalmazhatunk: az egyedi vagy a kombinált módosítást. Az első típus magában foglalja egy vagy több aminosav módosítását azok közül, amelyek a természetes vagy rövidített B és/vagy A láncban előfordulnak. Az ilyen módosítások lehetnek pl.: az aktív csoportok védelme egy vagy több aminosavon önmagában ismert módszerrel, és szükség esetén a védőcsoport eltávolítása a (módosított) A és B láncok kombinálása után. Az ilyen módosítások magukban foglalhatják az acetilezést, formilezést vagy a szabad aminocsoportok más védelmét, beleértve az N-terminálist is. a C terminális csoport amidálását, vagy a hidroxil- vagy karboxilcsoportokon az észterképződést. A formil-csoport egy jellemző példa egy könnyen eltávolítható védőcsoportra. 11 A módosítások második csoportja magában foglalja egy vagy több természetes aminosav helyettesítését az A vagy B láncban más aminosavakkal (beleértve a természetes aminosavak D-formáit is). A módosításnak ez az általános típusa magában foglalhatja a láncból egy természetes aminosav törlését vagy egy vagy több többlet-aminosav hozzáadását a láncba. Az ilyen módosítások célja növelni az A és B 1 ánc kombináció kitermelését úgy, hogy a terméknek, vagyis a relaxinnak vagy analógjának aktivitása megmaradjon, vagy növelni, illetve módosítani a termék aktivitását az adott kombináció kitermeléshez. Az ilyen módosítás kiterjedhet azokra a szintetikus analógokra is, amelyeknek relaxin-blokkoló vagy -antagonista hatása van. Az első típusú módosításnak jellegzetes példája a triptofán (Trp) gyök módosítása a B2 helyen formil-csoport bevezetésével. A második típusú módosításra példák: a Met rész helyettesítése a B 24-nél norleucinnal (Nie), valinnal (Val), alaninnal (Alá), glicinnel (Gly), szerinnel (Ser) vagy homoszerinnel (HomoSer). A találmány tehát magában foglalja azokat a humán relaxin analógokat, amelyek a találmány szerint fentebb leírt módon módosított természetes vagy rövidített B és/vagy A láncokból képződnek. Az A és B peptid láncokat, valamint a prorelaxint és preprorelaxint a gén-kifejeződés szokásos módszerével lehet előállítani, vagyis a megfelelő transzformált transzfer vektort tartalmazó mikroorganizmus növesztésével és a mikroorganizmus által termelt kívánt peptid (ek) kinyerésével és tisztításával. Az így előállított peptid termék lehet kapcsolt fehérje formájában, amelyben a kívánt peptid egy prokarióta fehérje egy részével van összekapcsolva. A találmányt a továbbiakban az alkalmazott kísérleti eljárások és az ilyen módon elért eredmények leírásával illusztráljuk. Anyagok és módszerek. Messenger íhírvívő) RNS izolálása és cDNS klónozás. Méhen kívüli terhesség sebészeti kezelése során nyert emberi petefészek szövetek gyorsan megfagyasztunk száraz jéggel és az RNS-t 5 mól/literes guanidin-tiocianátban (Merck) izoláljuk) Chirgwin és munkatársai módszere szerint (Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., Mac.Donald, R.J., és Rutter, W.J..: Biochem. 18,5294—5299 (1979)). A poli -A+ RNS- t átalakítjuk kettős szálú DNS-sé (Wickers, M.P., Buell, G.N. és Schimke, R.T.: J. Bioi. Chem. 253, 2483—2495 (1978)), és klónozzuk vagy a homopolimer G/C farokképző módszerrel pBR 322 plazmid vektorba (Chang A.C.Y.: Nature. 275, 617—624 (1978)) vagy a lambda-burkolat módszerrel ÄGT 10 vektort alkalmazva (Huynh és munkatársai 1983, személyes közlés). Tapasztalataink szerint a pBR 322 módszerrel történő transzformáció 12 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
