197766. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szérumtól független sejtvonalak előállítására
A szérumfüggő humán sejtvonal, amelyet a fenti folyamatban „kiindulási anyagaként alkalmazunk, elsősorban folyamatos sejtvonal és eredhet humán neoplazmákból, pl. melanómából, rosszindulatú teratómából, szarkómából, glioblasztómából, meningiómából, neuroblasztómából, lipomából, adenómából, tüdőkarcinómából vagy hólyagkarcinómából. Előnyös sejtvonalak azok, amelyek TPA-t vagy pre-TPA-t termelnek. A jelen találmány egy előnyös kiviteli módja szerint egy humán melanoma sejtvonalat alkalmazunk, elsősorban a Bowes melanoma sejtvonalat (ezután ezt „Bowes I" sejtvonalnak nevezzük). Normál humán szövetből származó sejtvonalakat is alkalmazhatunk „kiindulási anyag"ként, bár ezek csak korlátozott in vitro élettartammal bírnak (a növekedés megáll általában mintegy 50 sejtosztódás után), így kevésbé fontosak a jelen találmány szempontjából. A szérummentes tápközeg pl. kereskedelmi forgalomban kapható tápközeg, így pl. Eagle féle minimál tápközeg (MEM), MEM-Spinner tápközeg, Dulbecco által módosított Eagle tápközeg (DMEM), vagy Roswell Park Memorial Institute tenyésztő tápközeg (RPMI-1640). Egyéb, 'azonos értékű tápközegek ugyanúgy használhatók. A szérummentes tápközeg tartalmazhat megfelelő mennyiségű pufferoló szert, pl. nátrium-hidrogén-karbonátot, hogy a pH stabil maradjon. Mivel a sejtek tenyészetben meg vannak fosztva a kifinomult immunvédőrendszertől, amely integráns része az ép organizmusnak, előnyös antibiotikumokat, pl. penicillint, sztreptomicint, tilocint és hasonlókat, a tápközegbe vinni, hogy megakadályozzuk a tenyészet fertőzését. A normál humán sejtek rendesen csak akkor nőnek, ha a felülethez vannak rögzítve, míg a tumorsejtek gyakran készek nőni szuszpenzióban is. A laboratóriumi edények a rögzítéstől függő sejtekhez jól ismertek a szakterületek. Ezek tartománya a „mikroüreg” lemezektől és laposfenekű Petri-csészéktől a különböző méretű szövettenyésztő palackokig vagy folytonosan forgó, forgó palacknak nevezett hengeres edényekig terjed. A tapadástól független sejtek növekedhetnek olyan tenyésztő edényekben, amelyek mechanikusan vannak keverve, vagy ahol homogén szuszpenziót tarthatunk fenn gázáramlással végzett keveréssel. így pl. a jelen találmány szerinti eljárást kivitelezhetjük egy humán sejtvonal összefolyó vagy csaknem összefolyó egyrétegét tartalmazó szövettenyésztő lombikban; ez a humán sejtvonal lehet pl. humán melanoma sejtvonal, főleg Bowes I melanoma sejtvonal, amely szérumot tartalmazó tápközegben nő. A további eljárást nedves, széndioxidot tartalmazó atmoszférában hajtjuk végre, pl. olyan nedves atmoszférában, amely 95% levegőt és mintegy 5% széndioxidot tartalmaz, 35°C és 40°C közti hőmérsékleten, 4 5 elsősorban mintegy 37°C hőmérsékleten. A szérumot tartalmazó tápközeget eltávolítjuk és szérummentes tápközeggel, pl. RPMI-1640 vagy DNEM tápközeggel helyettesítjük. Néhány nap múlva sejtek kezdenek leválni a lombik felületéről, és szabadon úsznak a tápközegben. Néhány hét múlva a sejtek többsége a szérumtól és minden más növekedési faktortól megfosztott tápközegben elpusztul. Hogy a sejt életképességét fenntartsuk, elő-kondicionált tápközeget adunk a tenyészethez a szérummentes tápközeghez való adaptáció időtartama során. Ilyen elő-kondicionált tápközeget gyűjthetünk egy másik, társ-sejttenyészetből, amelyet egy adott időn át, pl 24 órán át, tartottunk szérummentes tápközegben. Az elő-kondicionált tápközeget tartalmazó, szérummentes tápközeget adott időközönként, pl 3—7 naponként cserélni kell, amíg a sejtszáma megfelelően megnövekedett, pl. addig az edény felületének egyharmada be lesz fedve. Ebben a stádiumban az elB-kondicionált tápközegre már nincs tovább szükség, és a sejteket kizárólag szérummentes tápközeggel tápláljuk. Amikor összefolyó egy-réteg (monolayer) keletkezett, a sejteket át kell oltani, pl. az edény erőteljes megcsapolásával, amely által a sejtek legnagyobb része elmozdul a felületről, vagy etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA) segítségével, gondot viselve arr, hogy a friss tenyésztő lombikok újraoltása megfelelően nagy sejt-sűrűséggel történjék abból a célból, hogy a túlélés biztosítva legyen. A sejtek növesztését és átoltását az összefolyásnál addig folytatjuk, amíg a sejtek stabil és tapadó egy-rétegként nőnek. Ilyen formában egy adott időtartam után, pl. 1—6 hónap, elsősorban 1—3 hónap után szérumtól független sejtvonalat alakítunk ki. Egy alternatív megközelítésben szérumtól független sejtvonaíat alakíthatunk ki egy szérum-függő társ-sejttenyészetből gyűjtött elő-kondicionált tápközeg hozzáadása nélkül, feltéve, hogy a sejtsűrűség elég nagy. Ebben az esetben a sejtek kondicionálják saját tápközegüket. A sejtsűrűséget úgy tarthatjuk magas értéken, hogy a nem-tapadó sejteket nem távolítjuk el. így pl. néhány nap múlva sejtmentes tápközegben a sejtek többségé leválik a szövettenyésztő edényről és szabadon lebeg a tápközegben, amint ezt fentebb leírtuk. A sejtek, amelyek leválnak, életben maradnak mindaddig, amíg azokat megfelelően nagy sűrűségben tartjuk. Ha nem tapadó, de élő sejteket tartalmazó szérummentes tápközeget centrifugálunk és a sejtüledéket friss, szérummentes tápközegben felvesszük és visszaadjuk a tapadó sejteket gyéren tartalmazó lombikokba, a tapadó sejtek gyorsan növekedni kezdenek. Ebben az esetben a szuszpenzióban levő sejtek a tapadó sejtekkel együtt kondicionálják saját tápközegüket. Két-három hét múlva a korábban szuszpenzióban levő sejtek kezdenek visszatapad* ni a tenyésztő edény felületére; ezek a sejtek 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 *30 65
