197766. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szérumtól független sejtvonalak előállítására
197766 bizonyos idő múlva tapadóvá válnak és át lehet oltani ezeket, amikor összefolyó réteget képeznek, élénk megcsapolással vagy EDTA segítségével, amint ezt fentebb leírtuk. A „kondicionált tápközeg” előállításának egy másik módszere a tapadó sejtek jelenlétében a szérummentes tápközeg egy részének, mintegy felének, kicseréléséből áll friss, szérummentes tápközeggel, és ennek a műveletnek az ismétléséből minden £4—72 órában, amíg elég nagy sejtsűrűséget kapunk (mintegy 3 hét múlva). A sitteket azután átoltjuk, pl. EDTA segítségévéT Áz első átoltásnál a friss, szérum-mentes tápközeget mintegy 40% olyan kondicionált tápközeggel egészítjük ki, amelyet a tenyészetből távolítottunk el az EDTA kezelés előtt; ez után már a sejtek folytatják az osztódást kondicionált tápközeg távollétében is. A sejtsűrűségnek megfelelően nagynak kell lenni, amely mintegy 30% vagy több, előnyösen 60—70% öszszefolyást jelent. Kis sejtsűrűségnél, pl. mintegy 20% öszszefolyásnál vagy mintegy 1.10° sejt/ml-nél szuszpenziós tenyészetek esetében a sejteknek szüksége van kondicionált tápközegre a növekedéshez. Nagy sejtsűrűségnél, pl. 60— 70%-os összefolyásnál vagy 2.10—5.105 vagy több sejtnél szuszpenziós tenyészet esetében a sejtek nőnek és burjánzanak szérummentes tápközegben kondicionált tápközeg hozzáadása nélkül is. A szérumtól független sejtvonalak növekedhetnek tapadó tenyészetként, pl. egy laboratóriumi edény belső falán, vagy szuszpenziós tenyészetként. A találmány kiterjed olyan új emberi sejtvonalakra, elsősorban humán melanoma sejtvonalakra is, amelyek képesek burjánzani sejtmentes tenyészközegben, különösen akkor, ha a jelen találmány szerinti eljárással készítjük ezeket. A jelen találmány a jelen találmány szerinti sejtvonalakból kapható mutáns sejtvonalakra is vonatkozik, amelyek képesek burjánzani szérummentes tenyészközegekben. Mutánsok keletkeznek spontán, vagy előállíthatok önmagukban ismert módszerekkel, így pl. mutánsokat kaphatunk kémiai módszerekkel, pl. valamely mutagén, pl. N-metil-N’-nitro-N-nitrozoguanidin vagy mustárolajok működtetésével, vagy besugárzással, pl. röntgen- vagy ultraibolya sugárzással. A jelen találmány szerinti előnyös, szérumtól független sejtvonalak és mutáns sejtvonalak azok, amelyek TPA-t és/vagy pro TPA-t termelnek. A jelen találmány szerinti új humán sejtvonalak és ezekből kapható mutáns sejtvonalak korlátlan élettartammal bírnak és hasonló módon alkalmazhatók, mint az eredeti, szérumíüggő sejtvonalak, pl. biológiailag aktív vegyületek, mint fehérjék, pl. interferonok, antigének, angiogén faktorok, és főleg plazminogén aktivátorok kereskedelmi ter7 meléséhez szérummentes körülmények között, vagy hibridóma sejtvonalak előállításához. Szérumtól független emberi sejtek tenyésztése és á tenyészfolyadék kinyerése A szérumtól független emberi sejteket lényegében úgy növeszthetjük, amint ezt fentebb leírtuk. így pl. Bowes II sejteket — előállíthatok Bowes I sejtekből (EP 41766) a találmány szerinti eljárással — oltunk szövettenyésztő lombikokba megfelelő sejtsűrűséggel, hogy a túlélést biztosítsuk, és nőni hagyjuk antibiotikummal kiegészített szérummentes tápközegben, pl. RPMI-1640-tápközegben, 35°—40°C közti, elsősorban mintegy 37°C hőmérsékleten nedves atmoszférában, mintegy 5% COa-t tartalmazó levegőben. A tápfolyadék kivétele elkezdődhet, mintegy a sejtek tapadóvá válnak, és ismételhető pl. 24 órás időközönként. A tápfolyadék naponkénti gyűjtése folytatódhat mindaddig, amíg az egy-réteg összefolyása szükségessé nem teszi az átoltást friss tenyésztő edénybe. Mivel a Bowes II sejtek burjánzási sebessége szérummentes tápközegben igen kicsiny (a kettőződési idő mintegy 6 napot tesz ki; összehasonlítva a szülő Bowes I melanoma sejtek mintegy 1 napos kettőződési idejével), ar. átoltás nem túl gyakran szükséges (mintegy 4—6 hetenként) és a tenyészfolyadékot egy lombikból mintegy 3—6 hónapon át lehet gyűjteni, így jelentős időt és erőfeszítést ledet megtakarítani, és a folyadékok összegyűjtése egyszerű feladat. Lehetséges alkalmanként fokozni a Bowes II sejtek burjánzási sebességét valamely növekedési faktornak, pl. inzulinnak hozzáadásával a tenyészközeghez. A Petri-csészék, szövettenyésztő lombikok és más, a laboratóriumi munkában használatos edények nem szolgáltatnak elég nagy felület/térfogat arányt a szérumtól független, felülethez rögzített sejtek gyakorlati, nagy léptékű tenyésztéséhez. A nagy léptékű termeléshez a terület/térfogat arányt különböző, a szakterületek ismert módokon lehet növelni. így pl. sejteket lehet növeszteni szivacsos polimereken, vékony lemezek kötegein, vagy kis gyöngyökön, és hasonlókon. Egy másik módszer szerint az új, szérumtól független sejtvonalakat, pl. a Bowes Il-t lehet szuszpenzióban is növeszteni. Nagy léptékű fermentorok, amelyek alkalmasak szüszperzióban való tenyésztésre, jól ismertek a szakterületek, és egysejtű mikroorganizmusokhoz való fermentorok módosításával vannak kifejlesztve. Abból a célból, hogy a sejteket egységesen szuszpendálva tartsuk a tápközegben, és egyenletesen oszlassuk el az oldott gázokat (pl. az oxigént), kevertetés szükséges. Ezt el lehet végezni hagyományos turbinakeverők, csavarlapáttal kialakított keverőszerkezet, függőlegesen oszcilláló vibráló keverő, stb. segítségével. A lassú keverés az előnyös abból a célból, hogy megakadályozzuk a sejtek károsodását. Homogén keverést lehet fenntartani olyan mó-8 5 T0 75 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
