197759. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a növekedési hormont felszabadító faktor analógjai előállítására

197759

Egyes jellemző, szintetikus peptideknek a növekedési hormon felszabadulását serkentő relatív hatékonyságát úgy határozzuk meg, hogy párhuzamos in vitro mérésekben, molárisán azonos koncentrációkban összehasonlítjuk a humán hasnyálmirigyből elkülönített növekedési hormon releasing faktor szintetikus úton előállított 1—40 fragmensének a C-terminálison szabad karboxilcsoportot tartalmazó, összehasonlító anyagként használt változatát a szintetikus úton előállított jellemző analógokkal. E célra patkányokból 3—5 nappal a mérés előtt eltávolított agyalapi mirigyből származó sejtek tenyészetét használjuk. Az ilyen sejttenyészeteket a növekedési hormon kiválasztása szempontjából optimálisnak tekinthetjük, az összehasonlító vizs-1 . TÁBLÁZAT

13

gálatokhoz ezeket a tenyészeteket használjuk a Vale és munkatársai által leírt [Edocrinology, 91, 562—572 (1972)], majd a Vale és munkatársai által részletesebben ismerte- 5 tett [Endocrinology, 112, 1553—1555 (1983)] módon. A vizsgálandó anyagot tartalmazó tenyészeteket 3—4 órán át inkubáljuk, majd a tenyészet közegéből meghatározott mennyiségű mintákat veszünk, ezeket feldolgozzuk, 10 és a mintákban lévő, immunreakcióra képes növekedési hormon mennyiségét egy meghatározott módon végzett radioimmun-assay módszerrel mérjük.

15 A molárisán azonos koncentrációkkal végzett összehasonlító vizsgálatok eredményeit az I. táblázatban adjuk meg.

14

Peptid

Relatív Optikai forgahatékonyság tókőpesség

M

d (c=1*

1%-os ecetsavban)

hGRF/1-40/-0H /összehasonlító anyag/ [D-NMA2 , Nie27]-hGRF/1-29/-NR2 [D-NMA2, Nie27]-hGRF/1-27/-NH2 [D-NMA2, Nie27]-hGRF/I-29/-NHCH2CH3

[D-NMA2, Nie27 Asn28] -hGRF/1-29/-NH2 [D-Leu“ ,Nle27L-rGRF/1-29/-NH2

[NI 0-7 °n1

D-Ar

— § 9] -rGRF/1-29/-RH2 [D-NMA2, Nie27]-rGRF/ 1 -29/-NH2'

[D-NMA2, D-Tyr10, Nie27] -hGRF/1-29/-NH2 [D-NMA2, Nie27 , D-Arg29] -hGRF/1-29/-NH2 [D-Tyr1, D-NMA2 — ’7 - ■ 0Q’ ---------[D-N^MeTyr1, D[Hi

is'

[D-NMA ^ ,

[d-nma2 ,

[D-NMA2 , [D-NMA2 , [Ac-Tyr .

D-NMA[ Ser

Nie NMA2,. Nie2 ^

D-Arg29] -hGRF/1 —29/ —Nil2

9 7 _ _ _ J. , . « _ , __

Nie2 \ Nie27 Nie

2 7

Nie2' -hGRF/I-29/-NH2 -hGRF/1-29/-NH2 Nie27] -rGRF/1 -29/-NH2 Asn28] -hGRF/1 -29/-NF.CH2CH3 -hGRF /1 - 28 / -NH CH 2 CH 3 -hGRF/1-32/-NH2

D-NMA2, Nie27] -hGFR/1-29/-NH2

100%

1330%-57,9

150%-56,8‘

1130%-57,0'

520%-57,6

120%-52,6'

386%-52,7

900%-51,9'

270%-56,7'

580%-57,8'

60%-57,5

30%-57,2'

260%-57,3'

260%-52,3'

1510%-56,9'

140%-56,5

820%-57,9

90%-56,8

Az in vitro körülmények között végzett qq vizsgálatok azt mutatják, hogy e szintetikus peptidek közül több vegyület meglepő módon erősebb biológiai hatást mutat, mint a humán hasnyálmirigy daganatból elkülönített növekedési hormon releasing faktor 1—40 frag- 55 mensének a C-terminálison szabad karboxilcsoportot tartalmazó változata, fgy például a [D-NMA2, Nie27] -hGRF(l-29)-NH2 képlettel jellemezhető peptid legkisebb hatásos koncentrációja körülbelül 1.10—12 mól. ^

A növekedési hormon kiválasztására gyakorolt hatás vizsgálatára szolgáló in vitro vizsgálatokon kívül in vivo vizsgálatokat is végzünk, e célból a szintetikus peptideket uretánnal altatott hím patkányoknak adjuk be intravénás (a vénába adott) injekció 35

8

formájában, és'meghatározzuk, milyen mértékben szorítják vissza e vegyületek a növekedési hormon spontán kiválasztását, anélkül, hogy felfüggesztenék az exogén (külső eredetű) növekedési hormon releasing faktorra adott válaszreakciót. Az állatok véréből mintákat veszünk, közvetlenül az injekció előtt, majd 10, 30 és 90 perccel az injekció után. Mind a 10 perccel, mind a 30 perccel az injekció után végzett mérések alápján a növekedési hormonnak a vérben radioimmun-assay módszerrel meghatározott szintjei azt mutatják, hogy a szintetikus [D-NMA2, Nie27] -hGRF (1— 29)-NH2képlettel jellemezhető peptid közel hatszor olyan erős hatást gyakorol az agyalapi mirigyből származó nödekedési hormon vérszintjére, mint a