197759. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a növekedési hormont felszabadító faktor analógjai előállítására
197759 Röviden úgy járunk el, hogy a gyanta 1 grammjára számítva 1—2 millimól, tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett aminosavat használunk diklór-metánban, plusz egy egyenértéknyi mennyiségű, 1,0 mólos diklór-metános diciklohexil-karbodiimid-oldatot, és az elegyet 2 órán át keverjük. A tercier -butoxi-karbonil-csoporttal és p-toluol-szulfonil-csoporttal védett arginin kapcsolását dimetil-formamid és diklór-metán 1:1 arányú elegyében végezzük. A szerin és a treonin oldalláncúban jelenlévő hidroxilcsoportot benzil-éter formájában védjük. Az aszparagin vagy glutamin amidocsoportját a diciklohexil-karbodiimiddel végzett kapcsolás során előnyösen xantilcsoporttal védjük. Az aszparagin vagy glutamin karboxilcsoportjának aktiválására p-nitro-fenil-észtercsoportot használunk, és például a tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett aszparagin p-nitro-fenil-észterét úgy kapcsolhatjuk, hogy a reakciót egy egyenértéknyi mennyiségű 1-hidroxi-benzotriazol jelenlétében, dimetil-formamid és diklór-metán 1:1 arányú elegyében végezzük, éjszakán át. Ebben az esetben diciklohexil-karbodiimidet nem adunk a reakcióelegyhez. A lizin oldalláncúnak védésére 2-klór-benziloxi-karbonil-csoportot használunk. Az arginin guanidinocsoportjának és a hisztidin imidazolgyűrűje 1-es nitrogénatomjának védésére p-toluol-szulíonilcsoportot használunk, és a glutaminsav vagy aszparaginsav oldalláncúnak karboxilcsoportját benzil-észter formájában védjük. A tirozin fenolos hidroxilcsoportját 2,6-diklór-benzil-csoporttal védjük. A szintézis végeredményeképpen a BOC-"Tyr (X2) -D-NMA-Asp (X3) -Ala-Ile-Phe-Thr(X4) -Asn(X5) -Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg(X6) -Lys(X7) -Val-Leu-Gly-Gln (X5) -Leu-Ser (X4) -Ala-Arg(X6) -Lys (X7) -Leu-Leu-Gln (X5) -Asp(X3)-Ile-Nle-Ser(X4)-Arg(X9) általános képletű vegyületet kapunk, ahol a fenti általános képletben X2 jelentése 2,6-diklór-benzil-csoport, X3 jelentése O-benzilcsoport, X4 jelentése benzilcsoport, X5 jelentése xantilcsoport, X6 jelentése p-toluol-szulfonil-csoport, X7 jelentése 2-klór-benziloxi-karbonil-csoport, és X9 jelentése -NH-[gyanta] általános képletű csoport. Az a-aminocsoport védőcsoportjának lehasításához használt trifluor-ecetsav hatására a xantilcsoport részlegesen vagy teljesen lehasadhat. A gyantához kapcsolt védett peptid védőcsoportjainak eltávolítása és a gyantáról való lehasítás céljából ezt a terméket a gyantához kötött peptid 1 grammjára számított 1,5 ml anizollal, 0,5 ml metil-etil-szulfiddal és 15 ml fluor-hidrogénsavval kezeljük —20°C hőmérsékleten félórán át, majd 0°C hőmérsékleten üjabb félórán át. Ezután a fluor-hidrogénsavat nagymértékben csökkentett nyomáson eltávo11 lítjuk, a gyantát és a peptidet tartalmazó maradékot felváltva vízmentes dietil-éterrel és kloroformmal mossuk, majd a peptidet levegőmentesített 2 normál vizes ecetsav-oldattal kivonatoljuk, és a gyantát kiszűrjük. A hasítás kitermelése lényegében 100%. A gyantáról lehasított és védőcsoportokat már nem viselő peptidet ezután feloldjuk 0—5%-os ecetsavban, és megtisztítjuk, például finomszemcsés Sephadex G—50-en való gélszűrés útján. Ezután a kapott peptidet preparatív vagy félpreparatív nagyfelbontású folyadék-kromatográfiás módszerrel tovább tisztítjuk, amint ezt Rivier és munkatársai [Peptides: Structure and Biological Function (A peptidek: szerkezet és biológiai hatás), 1979, 125—128], valamint Marki és munkatársai [J, Am. Chem. Soc., 103, 3178 (1981)] leírták. E célra egy Waters Associates prep LC—500 típusú készüléket használunk, az oszlopokat Vydac-féle, 300A jelzésű, 15—20 jj, szemcseméretű C]8- -szilikagéllel töltjük. Acetonitril és trietil-ammónium-foszfát-oldat felhasználásával, egy kisnyomású Eldex-féle készülék segítségével gradiens elúciót végzünk, amint ezt J. Rivier leírta [J. Liq. Chromatography, 1, 343—367 (1978)] . A kromatografált frakciók tisztaságát nagyfelbontású folyadék-kromatográfiás módszerrel gondosan ellenőrizzük, és csak a megfelelően tiszta frakciókat egyesítjük. A tisztaságra nézve egymástól függetlenül megvizsgált, tisztított frakciókat sómentesítjük, e célból acetonitril 0,1%-os trífluor-ecetsav-oldattal készült oldatával gradiens elúciót végzünk. A középső frakciókat fagyasztva szárítva a kívánt peptidet kapjuk, amelynek tisztasága nagyobb lehet, mint 98%. E célból a szintézis kezdetén a Vale és munkatársai által a 4 292 313. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett általános módszer szerint az aszparagint egy metil-benzhidril-amin-típusú gyantához kötjük. 2. példa Az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő az 1. táblázatban ismertetett szintetikus peptideket, melyek hatását in vitro körülmények között végzett biológiai vizsgálatokban összehasonlítjuk a humán hasnyálmirigy daganatból elkülönített növekedési hormon releasmg faktor szintetikus úton előállított 1—40 fragmensének a C-terminálison szabad karboxilcsoportot tartalmazó változatával [hpGRF(l-40)OH]. E vegyületek általában nagyobb mértékben serkentik a növekedési hormon kiválasztását, egyéb lényeges hatásaik pedig hasonlóak az összehasonlító anyag hatásaihoz. Megállapíthatjuk, hogy a jelen találmány szerinti összes szintetikus peptid biológiailag hatásos, és elvileg felhasználható a növekedési hormon felszabadulásának a serkentésére az agyalapi mirigyben. 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 T
