197759. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a növekedési hormont felszabadító faktor analógjai előállítására
197759 bodiimid és az N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid. További aktiválószereket és a peptidek kapcsolásához való alkalmazásukat Schröder és Lübke fent idézett művének 3. fejezete írja le, továbbá Kapoor, J. Pharm. Sei. 59, 1—27 (1970). Valamennyi védett aminosavat vagy pepiidet körülbelül négyszeres vagy ennél nagyobb fölöslegben visszük be a szilárd fázisú szintézishez használt reaktorba, és a kapcsolást dimetil-formamid és diklór-metán 1:1 arányú elegyében vagy tiszta dimetil-formamidban vagy tiszta diklór-metánban végezzük. Ha a kapcsolás nem megy végbe tökéletesen, akkor az a-aminocsoport védőcsoportjának lehasítása és a következő aminosavval való kapcsolás előtt ezt a kapcsolási műveletet megismételjük. Ha a szintézist kézi vezérléssel végezzük, akkor a kapcsolási reakció sikerét a szintézis minden egyes lépésében a ninhidrin-reakcióval ellenőrizzük, amint ezt E. Kaiser és munkatársai leírták [Anal. Biochem, 34, 595 (1970)]. A kapcsolási reakciókat elvégezhetjük automatikus úton is, például egy Beckman 990 típusú automata szintetizátorral, például a Rivier és munkatársai által leírt (Biopolymers, 1978, 17, 1927—1938) program alkalmazásával. A kívánt aminosavakat a megfelelő sorrendben tartalmazó peptidlánc kiépítése után a köztitermékként kapott pepiidet valamely reagenssel, például cseppfolyós fluor-hidrogénsavval való kezelés útján lehasíthatjuk a gyanta-hordozóról, ez a reagens nemcsak a pepiidet hasítja le a gyantáról, hanem az X, X2, X3, X4, X5, X6, X7 és X8 védőcsoportokat is lehasítja, továbbá az X9 helyén szereplő, a gyantához kapcsoló kémiai kötést is, továbbá az a-aminocsoporthoz adott esetben kapcsolódó X1 védőcsoportot is, és így a pepiidet szabad sav formájában kapjuk. Ha a peptidláncban metionin is van jelen, akkor előnyösen először trifiuor-ecetsav és 1,2-dimerkapto-etán-alkalmazásával lehasítjuk a tercier-butoxi-karbonil-csoportot, majd ezután hasítjuk le a pepiidet a gyantáról fluor-hidrogénsav segítségével, hogy így kiküszöböljük az esetleges S-alkilezést. Ha a hasításhoz fluor-hidrogénsavat használunk, akkor a reakcióelegyhez segédanyagként anizolt és metil-etil-szulfidőt is adunk. Az alábbi példákkal a szilárd fázisú peptid-szintézis előnyös kivitelezési változatait szemléltetjük, nyilvánvaló azonban, hogy valamely megfelelő, rövidpbb peptid fragmenst ugyanilyen módon állíthatunk elő, és ennek során egyszerűen elhagyunk megfelelő számú aminosavat a peptidlánc egyik vagy másik végéről. Jelenleg azonban az az álláspontunk, hogy a biológiailag aktív fragmenseknek az N-terminálison a megadott aminosavakat kell a megadott sorrendben tartalmazniuk. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban, a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül, példákkal szemléltetjük. 7 A jelen leírásban az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk: CH növekedési hormon (growth hormon) hpGRF emberi hasnyálmirigy-daganatból elkülönített növekedési hormon releasing faktor [human pancreatic (tumor) growth hormon releasing factor] rGRF patkány növekedési hormon 'releasing faktor (rat growth hormon releasing factor) pGRF sertés növekedési hormon releasing faktor (porcine growth hormon releasing factor) bGRF szarvasmarha növekedési hormon releasing faktor (bovine growth hormon releasing factor) Gly glicin Ala alanin Val valin Leu leucin He izoleucin Ser szerin Thr treonin Lys lizin Arg arginin Asp aszparaginsav Asn aszparagin Glu glutaminsav Gin glutamin Cys cisztein Viet metionin :3he fenil-alanin Tyr tirozin Pro prolin Trp triptofán His hisztidin Nie norleucin Nva norvalin pCl-Phe (p-klór-fenil)-alanin Na-Me-D-Ala Na-metil-D-alanin D-NMA N“-metil-D-alanin Na-MeTyr Na-metil-tirozin CaMePhe Ca-metil-fenil-alanin CaMeLeu Ca-metil-leucin CPMeHis Ca-metil-hisztidin NaMeHis Na-metil-hisztidin Ac acetilcsoport BOC tercier-butoxi-karbonil-csoport I péld ä A [D-NMA2, Nie27] -hGRF(l—29)-NH2 képlettel jellemezhető, H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala- Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-Ile-Nle-Ser-Ar g-NH2 képletü peptidet stepwise módszerrel, egy Beckmann 990 típusú peptid-szintetizátorban állítjuk elő egy metil-benzhidrilamin-gyantán, amelynek kapacitása körülbelül 0,1—0,5 millimól/g gyanta. A p-toluol-szulfonil-csoporttal arginint a 4 292 313. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett általános módszerrel kapcsoljuk a gyantához. 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
