197757. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kromogén vegyületek előállítására
197757 C-lépés 7- (N(C-Boc-D-fenilalani)-L-propil-N&-Mtr-a rginilamino)-3-die tilamino-8-metil-fenoxazónium-hidroklorid A B-lépés szerint előállított termék 720 mgját 135 mg hidroxi-benzo-triazollal és 362 mg Boc-D-Phe-Pro-OH-val együtt 25 ml dimetil-íormamidban oldjuk, és az oldatot jeges fürdőn 4°C-ra hütjük. 215 mg d ici klohexi 1 - ka rbodiimid hozzáadása után az elegyet 4°C-on még két órán át, majd szobahőmérsékleten 12 órán át keverjük. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük. Az oldószer elpárologtatása után kapott olajos maradékot Kíeselgélen (100 g Kieselgél 60, szemcseméret 40—63 pm) a D-oldószereleggyel karomatografáljuk. A kapott termék további tisztítása Sephadex® LH20 adszorbensen metanollal történik. Hozam: 290 mg Vékonyréteg-kromatográfia: D-oldószerelegyben R; = 0,48 D-lépés 7- (D-fenilalanil-L-propi!-L-arginilamino)-3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-triacetát A C-lépésben kapott szubsztrátum 200 mg-ját alaposan megszárítjuk, majd 40°C-on 4,5 ml trifluorecetsav és 0,5 ml anizol elegyével 4 órán át kezeljük. A savat vákuumban ledesztilláljuk és a maradékot CM-cellulózon (Whatman CM 32, ammónium-acetát gradiens 0,01 M (pH 4,5 és 0,3 M (pH 6,8) között tisztítjuk. Az eluáláshoz használt puffert többszörös liofilizálással eltávolítjuk. Hozam: 135 mg piros por Vékony réteg-kromatográfia: E-oldószerelegyben R/ = 0,27 aminosavelemzés: Phe = 0,98 Pro = 1,04 Arg = 1,00 peptidtartalom: 96% 2. példa 7-(L-alanil-L-alanil-L-feni!alanil-amino) - -2-dietitamino-8-metil-fenoxazónium-diacetát I-lépés 7- (Boc-L-feni lal anil-a minő) -3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-hemiletraklórcinkát 1,33 g Boc-L-Phe, 1,41 g 7-amino-3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-hemitetraklórcinkát és 0,76 g hidroxi-benzo-triazol 50 ml dimetil-íormamiddai készített oldatát 0°C-ra hú'tjük, majd 0,55 g N-metil-morfolínt és 1,05 g diciklohexil-karobodiimidet adunk hozzá. A reakcióelegyet 2 órán át jeges fürdőn, 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük, utána a kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük és a maradékot metanolban oldjuk. A terméket éter hoz záadásával kicsapjuk, a kristályokat leszivat 5 juk és nagyvákuumban szárítjuk. Hozam: 1,95 g Vékonyréteg-kromatográfia: C-oldószerelegyben R/ = 0J7 2. lépés 7-L-íenilalanil-amino-3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-dihidroklorid Az 1. lépés szerint kapott termék 1,8 g-ját a Boc-csoport eltávolítása céljából 50 ml saveleggye! (1,2 n HCl/jégecetet) 25 percen át kezeljük. A reagenst vákuumban ledesztilláljuk, és az olajos terméket kétszer toluol lal lepároljuk. A maradékot vízben oldjuk és az oldatot butanol és etil-acetát 1:2 térfogatarányú elegyével kétszer extraháljuk. A vizes fázist liofilizáljuk. Hozam: 1,65 g Vékonyrétegkr.: D-oldószerelegyben Rf = 0,26 3- lépés 7-(Boc-L-alanil-L-alanil-L-fenilalaniI-ami-no-3-dietilamino-8-metil-fenoxazonium-hidroklorid 1 g Boc-Ala-Ala-OH, 0,58 g hidroxi-benzo-diazol és a 2. lépésben előállított termék 1,6 g-ját 50 ml dimetilformamidban oldjuk és az oldatot jeges fürdőn hütjük. 0,8 g díciklohexil-karbodiimid és 420 pl N-metil-morfolin hozzáadása után az elegyet jeges fürdőn 1 órán keresztül, majd szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük, utána szűrjük. A szűrletet vákuumban bepároljuk. Az olajos maradékot Kíeselgélen (100 g Kieselgél, szemcseméret 40—63 pm) a D-oldószereleggyel kromatografáljuk. A termék további tisztítása SephadexR LH20 adszorbensen metanollal történik. Hozam: 820 g Vékonyréteg-kromatográfia: D-oldószerelegyben R/ = 0,45 4- lépés 7- (L-ala nil- L-al anil -L-feni lal anil-amino-. -3-dietil-amino-8-metil-fenoxazónium-diacetát A 3. lépés szerint kapott termék 3 g-ját 20 ml savelegyben (1,2 n HCl/jégecet) 25 percen át keverjük. A savat vákuumban ledesztilláljuk, még megmaradt savnyomokat úgy tüntetjük el, hogy a termék felől kétszer toluolt desztillálunk el. A maradékot ioncserélő kromatográfia segítségével (Whatman CM 32, ammóniumacetát gradiens 0,01 M (pH 4,5) és 0,3 M (pH 6,8) között) tisztítjuk. A tiszta termék 1 iofilizá 1 ásakor kristályosán keletkezik. Hozam: 160 mg Vékonyréteg-kromatográfia: E-oldószerelegyben Rf = 0,53 Aminosavelemzés: Alá 2,06 Phe 1,00 peptidtartalom: 89% Hasonló módon az alábbi táblázatban öszszefoglalt szubsztrátumokat állítjuk elő. 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4
