197757. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kromogén vegyületek előállítására
197757 A találmány tehát eljárás (1) általános képletű, kromogén szubsztrátumok előállítására. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy egy (11) általános képletű fenoxazinszárazékot védett aminosavval, aminosavszármazékkal vagy pepiiddel reagáltatunk. Azokat a csoportokat, amelyeket a C-terminális aminosavnak a színezék primer aminocsoportjához történő kapcsolása közben nem kívánunk reagáltatni, reaktivitásuknak megfelelően védeni kell Ideiglenes védőcsoportként előnyösen uretántípusú, védőcsoportot, például a terc-butiloxikarbonil-csoportot, a benziloxikarbonilcsoportot vagy a bifenil-propiloxikarbonil-csoportot alkalmazzuk. Az aminosavak, illetve peptidek reakcióképes oldalláncait a további peptidszintézis miatt is elláthatjuk védőcsoportokkal. így az arginin guanidinocsoportját nitrocsoporttal tozilcsoporttal vagy protonálás útján védhetjük, az aszparaginsav és glutaminsav karboxil csoportját észterezhetjük, az ornitin és a lizin aminocsoportját uretán típusú védőcsoporttal védhetjük, és a tirozin fenolos csoportját átérezhetjük. A védőcsoport-kombinációt a peptidkémia szokásos, ismert technikáinak az adottságaitól függően választjuk meg, a fenti felsorolás csak példaképpen szerepel. Az amid-, illetve peptidkötések kialakítását a peptidkémiában szokásos módszerek szerint végezzük. Általában a védett aminosav, illetve pepiid karboxilcsoportját aktiváljuk és a reakciópartner aminocsoportjával reagáltatjuk. A karboxilcsoportok aktiválása például karbodiimid-, azid-, anhidrid-, savklorid- vagy aktívészter-módszer szerint történhet; a komponensek kapcsolását a szokásos oldószerek, igy dimetil-íormamid, diklór-metán, kloroform, piridin, dimetil-szulfoxid vagy hexametilén-foszforsav-triamid jelenlétében végezzük, adott esetben bázis adagolása mellett. A találmány szerinti eljárás keretében a kiindulási anyagként alkalmazott fenoxinszármazékokat a megfelelő izocianátokká is alakíthatjuk, majd ezeket az N-terminálisan védett aminosavval reagáltatjuk. Kromofórként a (III), illetve a (IV) képletű színezéket (Colour Index Basic Blue 49 és Colour Index Basic Blue 124) alkalmazzuk. Ezek mélykék kromofór vegyü letek, DCC/ /HOBt-eljárással védett aminosavval reagáltatva piros vegyületet kapunk. Aminosavként arginint alkalmazva az N^-csoportot Boc-, Z- vagy -Fmoc-csoporttal, az N6 -csoportot nitro-, Di-Z- vagy Mtr--csoporttal védjük, míg lizin alkalmazása esetén a Boc/Z kombinációt választjuk. A (III) és a (IV) képletű kromofór felhasználásával kapott (I) általános képletű vegyületek a spektrális tulajdonságaikban alig különböznek egymástól, az abszorpciós maximumok között 5 nm-nél kisebb a különbség. Fiziológiás puffer-rendszerben a színezékek abszorciója 625 nm-nél van, míg a peptidkötéssel kötött színezék abszorciója 545 nm-nél jelentkezik. 3 A di-, tri-, tetrapeptid-szubsztrátumok felépítése lépcsőzetesen, tehát védett, aktivált aminosavak bevitelével történhet. Előnyösen azonban védett, aktivált oligo-peptideket alkalmazunk. Az N-terminális aminosavak előnyösen D-formájúak, vagy pedig védőcsoporttal vagy az N-terminálist irreverzibilis módon blokkoló csoporttal, például tozil-, benzoil, acetiI-, benzoiloxi-karbonil-csoporttal rendelkeznek. Az adott esetben lehasítani kívánt permanens védőcsoport lehasítását előnyösen a szintézis végén végezzük. Acidolitikusan eltávolítható védőcsoportokat 1—2 n HC1, ecetsav vagy trifluorecetsav segítségével hasítunk le. Hidrogenolitiküsan eltávolítható védőcsoportokat palládium csontszén katalizátor jelenlétében végzett hidrogénezéssel távolítjuk el; eközben a kromofór színe ideiglenesen eltűnik. Az In -védőcsoport minél kíméletesebb eltávolítása érdekében előnyösen olyan csoporttot választunk, amely enyhén savas körülmények között már lehasad. Különösen előnyös nek az NG-Mtr-csoport bizonyult. A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük. (Lásd alkalmazott rövidítések). 1. példa 7- (D-feniialanil-L-propil-L-arginilamino) - -3-dieitlamino-8-meti!-íenoxazónium-triacetát A lépés 7- (N^-Boc-N -Mtr-L-arginilamino) -3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-triacetát-hemitetraklórcinkát 4,3 g N-Boc-NG-Mtr-L-arginin, 2,54 g 7- -amino-3-dieti!amino-8-metil-fenoxazónium-hemitetraklórcinkát és 1,22 g HOBt 100 ml dimetil -formamiddal készített oldatához 1,1 ml N-metil-morfoIint adunk, az elegyet jeges fürdőn hütjük, majd 2,1 g diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá. Két óra elteltével a reakcióhelyet szobahőmérsékletre melegítjük és ezen a hőfokon 6 órán át állni hagyjuk. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és az oldószert vákuumban bepároljuk. A maradékhoz butanolt adunk, az oldatot vízzel háromszor extraháljuk, majd vákuumban kis térfogatra betöményítjük. A terméket etil-acetáttal kicsapjuk, a kristályokat kiszűrjük és nagyvákuumban szárítjuk. Hozam: 4,7 g; vékonyréteg-kromatográfiásan meghatározott Rj-értékek: A-oldószerelegyben Rf = 0,15; B-oldószerelegyben Rf = 0,39. ß lépés 7 - N°-Mtr-arginilamino-3-dimetilamino-8-metil-fenoxazónium-hidroklorid Az A-lépés szerint kapott termék 1,2 g-ját 50 ml saveleggyel (1,2 n HCI/ecetsav) 30 percen keresztül kezeljük. A hidrolizálószert vákuumban elpárologtatjuk, kétszer toluolt adva az elegyhez. Liofilizálás után 950 mg piros kristályport kapunk. Vékonyréteg-kromatográfia: az A-oldószerelegyben R/ = 0,17 4 3 5 10 1E 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
