197757. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kromogén vegyületek előállítására
197757 A találmány új kromogén vegyületek előállítására vonatkozik. Az új vegyületek diagnosztikai célokra enzim-szubsztrátumként alkalmazhatók, például proteolitikus. enzimek kimutatására, főleg endoproteázok mennyiségi meghatározására, különösen olyan endoproteázoké, amelyek peptideket és proteineket aminosavak, így arginin, lizin vagy aromás oldalláncú aminosavak után hasítanak. A kromogén vegyületek tehát minden olyan reakció kvantitatív meghatározására alkalmazhatók, ahol a fenti enzimek keletkeznek, elfogynak vagy inhibitálódnak. A fenti célokra — a technika állása szerint — aminkötéssel peptidekhez vagy peptidszármazékokhoz kapcsolt, proteolitikus enzimekkel lehasítható kromofórok használatosak. így például olyan peptidszubsztrátumok ismeretesek, amelyekről az említett enzimek fotometriásan vagy fluorimetriásan mennyiségileg meghatározható csoportokat hasítanak le (0046 742 számú közzétett európai szabadalmi bejelentés, 32 440 30 számú NSZK-beli közrebocsátási irat). Enzimek fotometriás meghatározására mindezidáig többnyire a paranitranilin peptidszáramazékait alkalmazták. Az enzimmel lehasított para-nitranilin 405 nm hullámhosszon mérhető. A kromogén szubsztrátummal szemben támasztott követelmények egyike az, hogy a teszt-közegben jól oldódjék, továbbá hogy nagy érzékenységű, speciíitású, valamint könnyen kezelhető és detektálható legyen. Az eddig alkalmazott szubsztrátumok esetében ezek a feltételek nem kielégítő módon teljesülnek, ezért igény mutatkozik jobb szubsztrátumok iránt. A para-nitranilin, illetve származékai esetén főleg a fotometriás kiértékelés hátrányos, mert a 405 nm-nél történő mérést plazma-alkotók és egyéb testnedvek zavarhatják. Az 580 nm-nél történő mennyiségi meghatározás céljára már ismertek olyan anyagok, amelyek a szubsztrátum hasítása után kémiai reakciók eredményeként elszíneződnek, de ezek a reakciók csak a végpont felismerését teszik lehetővé, tekintettel arra, hogy a' szerves vagy szervetlen vegyszerek adagolása az enzimes reakció kinetikai követését gyakran zavarja vagy lehetetlenné teszi (76 042 számú, közzétett szabadalmi leírás; H.C. Kwaan et al., Thromb. Rés. 13, 5—13, 1978). A találmány feladata jól oldódó, előnyös speciíitású kromogén vegyületek felkutatása volt, amelyekkel vér, plazma-alkotók vagy egyéb testnedvek jelenlétében proteolitikus enzimek minőségileg és mennyiségileg meghatározhatók. A fenti célra alkalmasnak az (I) általános képletű vegyületeket találtuk. Az (I) általános képletben X jelentése hidrogénatom, 2—5 szénatomos alkoxikarbonil-, benziloxikarbonil- vagy p-toluol-szulfonil-védőcsoport, 1 A és B jelentése az L-AIa kivételével eltérőek, és A jelentése Gly, L-Ala, D-Ala, D-Val, D-Leu, D-Ile, D-Phe, D-Pro, L-Glp, B jelentése Gly, L-Ala, L-Leu, L-Phe, L-Tyr, L-Pro, L-Pip, L-Glu-Gly, L-Leu-L-Pro, C jelentése L-Arg, L-Phe vagy L-Lys, R7 jelentése metil- vagy metoxicsoport, és An~ jelentése acetát-, klorid- vagy egy egyenértéknyi ZnCl^ion. Az (I) általános képletű vegyületek lényeges eleme a heteroaromás kromofór, amely a technika állását meghaladó előnyöket biztosít. Meglepő módon azt találtuk, hogy ha a (II) általános képletű kromofórhoz — a (II) általános képletben R7 jelentése a fenti — aminosavat kapcsolunk, legalább 70 nm-nyi hipszokróm eltolódás jön léire. Ez azt jelenti, hogy az eredetileg kék színezék peptidkötésben piros színt mutat. A fentiek szerint a találmány (I) általános képletű vegyületek előállítására vonatkozik. Az (I) általános képletű vegyületek a (II) általános képletű színezéket kovalens kötéssel kötve tartalmazzák; a szabad és a kötött színezék abszorpciós hullámhossza között legalább 70 nm eltérés van, és a szabad kromofór abszorpciós hullámhossza 550 nm-nél hosszabb. Tekintettel arra, hogy az abszorpciós maximum hosszabb hullámok felé tolódott el, a tesztcsíkok fotodióda-technikával vagy reflektometriás úton is kiértékelhetők; ez a rövid hullámú tartományban, például 405 nm-nél nem lehetséges. A kedvező spektrális tulajdonságok lehetővé teszik az enzim aktivitás testnedvek, például vér jelenlétében történő mérését, mert a színezék, rendszer abszorpciós hullámhossza a hemoglobin abszorciós hullámhosszától eléggé távol van. Előnyös a hagyományos fotométer-rendszerekkel történő kiértékelés lehetősége. A (II) általános képletű színezékek morális extinkciós együtthatója a para-nitranilinét a 6—10- szeresen meghaladja. Előnyös továbbá, hogy az (I) általános képletű vegyületek igen jól oldódnak és szubsztrátumként igen kedvező specifitást mutatnak. Az (I) általános képletű vegyületeket a peptidkémiában szokásos módszerekkel állítjuk elő. Az alkalmazott aminosavak — amennyiben másképp nem tüntetjük fel — előnyösen L-konfigurációjúak. Az aminosav kifejezés itt többnyire természetes aminosavat jelent. Az új kromogén vegyületek a dibenzo-1,4- oxazmtól (fémoxazin) leszármaztatható kromofór csoportot tartalmaznak. Amint a (II) általános képlet mutatja, az ilyen színezék auxokróm csoportot, különösen dialkil-amino-csoportot, és a dialkil-amino-csoporthoz képest tükörszimmetrikusan elhelyezkedő aminocsoportot tartalmaz. Az aromás váz primer aminocsoportja képes aminosavakkal, illetve peptidekkel amidkötés kialakulása közben reagálni. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
