197745. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pirido[2,3-b] [1,4]-benzodiazepin-6-on származékok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
197745 A következő kísérletek eredményei bizonyítják, hogy mutatkoznak ezek a meglepően előnyös hatások a találmányunk szerint előállított vegyületek alkalmazásakor. A) A muszkaringátló hatás funkcionális szelektivitásának vizsgálata A muszkaringátló hatású vegyületek gátolják a külső eredetű agonistáknak a befolyását, illetve annak az acetil-kolinnak a hatását, amely az akarattól függetlenül működő idegek végződésein szabadul fel. A következőkben olyan módszereket ismertetünk, amelyek alkalmasak a kardioszelektív, muszkaringátló hatású vegyületek érzékelésére. „In vitro” szervpreparációk „In vitro" állapítottuk meg tengerimalacok esetében a disszociációs állandókat ileumon, valamint spontán verő pitvaron. Az ileumot eltávolítottuk és Krebs-Henseleit-féle oldatban inkubáltuk egy szervíürdőben. öszszehúzódásokat váltottunk ki a metakolin (M) koncentrációjának a növelésével olyan módon, hogy fel tudtuk venni a teljes koncentráció-hatásgörbét. Ezután metakolint mostunk ki, amelyet a vizsgálandó anyaghoz vezettünk és azzal 30 percen keresztül érintkeztettünk. Ezután ismét felvettük a koncent ráció-hatásgörbét. A dózisviszonyból (DR) — amely a koncentrációs hatásgörbe eltolódásának a mértéke— kiszámítottuk a disszociációs állandókat Arunlakshana és Schild módszere szerint (Brit. J. Pharmacol. 14. 48. (1959)). Az elkülönített, spontán verő jobb pitvaron csökkent a szívfrekvencia metakolin koncentrációtól való függősége. Abban az esetben, ha beadagolunk valamilyen muszkaringátló anyagot, ezt az effektust ismét meg lehet növelni. A pitvar muszkarinreceptoriara vonatkozóan a disszociációs konstansokat is az előbb leírt módon lehet meghatározni. A mindkét szövetre meghatározott disszociációs állandóknak az összehasonlításával lehetővé vált a kardioszelektív anyagok azonosítása. Az eredményeket a IV. táblázatban foglaltuk össze. „In vivo" módszerek Az alkalmazott módszerekkel az a célunk, hogy megállapítsuk a muszkaringátló hatás szelektivitását. Mindazokat az anyagokat, amelyeket az „in vitro” vizsgálatok alapján kiválasztottunk, alávetettük a következő vizsgálatoknak is: 1. A tachikardiális hatás vizsgálata ébren levő kutyán. 2. Az Mr/M2-szelektivitás vizsgálata patkányokon, és 3. A nyálkiválasztás gátlásának vizsgálata patkányokon. l.A szívverés szaporaságát fokozó hatás vizsgálata ébren levő kutya esetében A vizsgált vegyületeket vagy intravénásán injektáltuk be vagy szájon keresztül jut9 tattuk be a kutya szervezetébe. A szívverés szaporaságát egy tachikardiográffai mértük. Egy bizonyos kontroli-időtartam eltelte után a vegyületeket megnövelt dózisokban alkalmaztuk, hogy megnövekedjék a szívfrekvencia. Mindig olyankor alkalmaztuk a következő dózist, amikor az előző dózisnak a hatását már nem lehetett észlelni. Grafikusan állapítottuk meg minden egyes anyagra azt a dózist, amely percenként 50-nel növelte a szívverést (ED50). Minden egyes vegyületet 3—5 kutyán vizsgáltunk. Az eredményeket a II. táblázatban adtuk meg. 2. Az Ml-/M2-szelektivitás patkányokon Az alkalmazott módszert Hammer és Giachetti ismertette (Life Sciences, 31. 2991 — 2998 (1982)). A vegyületek növekvő dózisokban való intravénás beadagolása után 5 perccel elektromosan stimuláltuk a jobboldali bolygóideget (a frekvencia: 25 Hz; impulzus-terjedelem: 2 ms; ingertartam: 30 s; feszültségérték: szupramaximális), illetve McN-A-343- ból 0,3 mg-ot adtunk be kg-onként hím THOM-patkányoknak intravénásán. Meghatároztuk a bolygóideg stimulálásának hatására fellépett szívverés-lassúbbodást, valamint az McN-A-343 által okozott vérnyomásemelkedést. Grafikusan határoztuk meg az anyagoknak azokat a dózisait, amelyek a bolygóidegre gyakorolt hatás következtében fellépő bradikardiát (M2) vagy a vérnyomásnövekedést (M,) 50%-kal csökkentették. Az eredményeket a III. táblázatban foglaltuk össze. 3. A nyálkiválasztást gátló hatás vizsgálata patkányokon Lavy és Mulder szerint (Arch. int. Pharmacodyn. 178. 437—445 (1969)) tartottuk fenn intravénás adagolással növekvő dózisokat 1,2 g/kg uretánnal narkotizált, hím THOM-patkányoknál. A nyálkiválasztást 2 mg/kg pilokarpin s.c. adagolásával váltottuk ki. A nyálat itatóspapírral felitattuk és a nyál által elfoglalt felületeket 5 percenként planimetriásan meghatároztuk. Grafikus módszerrel állapítottuk meg azokat az anyagdózisokat, amelyek a nyálkiválasztás 50%-os csökkenését eredményezték. Az eredményeket a III. táblázatban szerepeltetjük. B) A muszkarinreceptorokon való kötődés vizsgálata 1 .„In Vitro": az IC50-értékek meghatározása Szervdonorként hím Sprague-Dawley patkányok szolgáltak, amelyeknek a súlya 180 és 220 g között volt. A szív, a submandibularis és a nagyagykéreg kivétele után az öszszes további lépést jéghideg Hepes-HCl-pufferben (pH=7,4; 100 mmól NaCI, 10 mmól MgCl2) valósítottuk meg. A teljes szivet szétdaradoltuk egy ollóval, végül minden szervet egy-egy edényben homogenizáltuk. A kötődés meghatározásához a szervekből készített homogenizátumot a következő arányokban hígítottuk: 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
