197595. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektorok előállítására
197595 doló régióban, illetve az annak végén elhelyezkedő egyedi Pvull, illetve Hindii! hasítási helyek teszik lehetővé. A következő átalakítások célja az volt, hogy kialakítsunk egy vektorcsaládot, amely lehetővé teszi idegen gének beépítését a legáltalánosabban használt restrikciós endonukleázokkal, mindhárom leolvasási fázisban. Hasonlóképpen felmerült annak is az igénye, hogy a fehérje termeltetése egyaránt megvalósítható legyen önálló fehérje formájában, valamint egy stabil E.coli fehérjéhez kapcsolva ún. fúziós pepiidként. [Erre az utóbbi megközelítésre akkor van szükség, ha a fehérje féléletideje a baktériumsejtekben rendkívül rövid (pl. humán proinzulin). Ilyen esetben a fúziós peptid N-terminálisát alkotó coli fehérje képes megvédeni a lebomlástól a különben instabil idegen fehérjét] . Mindezen célok megvalósítására első lépésként mindkét orientációban beklónoztunk a pER-VI/23 plazmid HindlII helyére egy 109 nukleotid hosszú HindlII-HindlII polilinkert, amely a nVX miniplazmidból származott (T. Maniatis et al., Molecular cloning, A laboratory manual 1982, Cold Spring Harbour p. 353.), és a HindlII hasítóhelyen kívül Clal, EsoRI, BamHI, PstI, BglII, Xbal restrikciós hasítóhelyeket tartalmazott. (8. ábra, HindlII-HindlII polilinker). Eredményül a pER-VI/23 PLH4, illetve a pER-VI/23 PLH5 plazmidokat kaptuk, amelyekben a polilinker orientációja a 8. ábráéval megegyező, illetve fordított. Ezekben a plazmidokban és a továbbiakban leírtakban, valamennyi leolvasási fázisban van egyedi restrikciós hasítóhely, ami lehetővé teszi tetszőleges idegen gén beépítését, majd az idegen fehérje expresszáltatását az a-peptiddel fúzionált formában. Az irodalomból ismert tény azonban, hogy különböző fúziós • peptidek esetében eltérő hosszúságú p-galaktozidáz rész nyújtja a maximális védelmet. Ezért elkészítettük a vektorcsalád két további tagját, A pER-VI/23 PLH4 plazmid Pvull, Clal helyére beépítettük a lacZ gén (az E.coli ß-galaktoziddz génje) 733 nukleotid hosszú Pvull, Clal fragmentumát, amely a ß-galaktozidäz következő 244 aminosavát kódolja. Az így kapott plazmid neve p med/23. Hasonlóképpen a pER-VI/23 PLH4 Pvull, EcoRI helyére beépítettünk egy 1171 nukleotid hosszúságú nukleotid darabot, amely a lacZ gén 1621 nukleotid hosszúságú Pvull, EcoRV fragmentjéből és a kloramfenikol-acetil - -transzferáz (CAT) gén (a pBR329 plazmidból, Gene 17, 1982, 79—89) 150 nukleotid hosszúságú Pvull, EcoRI fragmentjából épült össze az EcoRV, Pvull tompa végek összekapcsolása révén, és az elejétől a végéig nyílt leolvasási fázisban van. Ez a plazmid a pL-alfa Int/23 nevet kapta. A pER-VI/23 PLH4, pER-VI/23 PLH5, valamint a pL-alfa Int/23 plazmidnak elkészült a nagykópiaszámú változata is [lásd T/35280 közzétételi számú magyar szabadalmi bejelentés]. 9 6 A plazmidcsalád eddig tárgyalt tagjai segítségével tetszőleges idegen fehérje előállítható olyan fúziós peptid részeként, melynek az első 70 [pER-VI/23 PLH4, pER-VI/23 PLH5], 280 [p med/23] vagy 390 [pL-alfa Int/23] aminosav hosszúságú része E.coli fehérjéből (ß-galaktozidäz, CAT) származik. (9. ábra az eddig tárgyalt plazmidok sematikus rajza). Felmerült a kérdés, hogy mi a teendő akkor, ha az idegen fehérjét intakt tormában, nem fúziós peptidként kívánjuk termeltetni. Az eddig tárgyalt konstrukciók erre is lehetőséget nyújtanak, ha az idegen gént úgy építjük be a vektorba, hogy az E.coli gén részleten (lacZ vagy lacZ-j-CAT) induló transzláció közvetlenül a beépített gén start kodonja előtt álljon le, és/vagy az idegen gén rendelkezzen erős E.coli riboszomakötőhellyel. Ebben az esetben a konstrukció két génes bakteriális operonhoz hasonlóan működik. Az ilyen két génes rendszerben azonban, az expresszió optimalizálása sokszor nehezen valósítható meg (bizonytalan), ezért kívánatosnak tűnt a vektorcsalád olyan tagjainak kifejlesztése, melyek univerzálisan alkalmazhatók fehérjék önálló kifejeztetésére. Ennek megvalósítására a pER-VI/23 PLH4 plazmidból el kellett távolítani az alfa-j>eptid kódoló régiót, úgy, hogy a lac transzlációs kontroll szekvenciák megmaradjanak, és megfelelő estrikciós hasítóhelyet kellett beépíteni azoktól optimális távolságra. Mindezt több lépésben sikerült megvalósítani. Először a pERVI/23 PLH4 piazmid egyedi Nsil, Pvull helyére beépítettük az ugyanebből a plazmidból származó Nsil, Alul fragmentet. A 7. ábráról leolvasható, hogy az Alul restrikciós hasítóhely közvetlenül megelőzi a transzlációs start kódont, valamint az is látszik, hogy az Alul hely bal fele egyben egy fél Pvull hely is. így helyes összekapcsolódás esetén a Pvull hasítóhely regenerálódik. Az eredményül kapott plazmidot pER-VI/23 ]-ATG]-nek neveztük el, ugyanis ez a konstrukció olyan gének kifejeztetésére alkalmas, amelyek rendelkeznek saját ATG transzlációs starthellyel. Ezek a gének tompa végek kialakítása után építhetők be az újonnan keletkezett egyedi Pvull restrikciós helyre. Az idegen gén hatékony kifejeztetése akkor lehetséges, ha az ATG kodonját megelőzően nem több mint 8 (optimálisan 4) nukleotidot tartalmaz. Ebben az esetben ugyanis a lac eredetű riboszomakötőhelynek és a gén transzlációs start kodonjának a távolsága optimális, vagy annak közelében van. Elsősorban szintetikus gének kifejeztetésének a megkönnyítésére a pER-VI/23[-ATG] plazmidot tovább alakítottuk. Az említett Pvull restrikciós hasítóhelyre egy Clal enzim hasítóhelyet tartalmazó ún. Clal linkért építettünk be, majd az újonnan keletkezett, valamint a polilinker régióban lévő Clal hely közötti DNS darabot eltávolítottuk. Ezt Clal 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
