197595. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektorok előállítására
197595 restrikciós emésztéssel, majd az eredményül kapott nagyobb DNS fragment újbóli cirkularizációjáva! valósítottuk meg. így jutottunk el a pER-VI/23 [+ATG] jelű plazmidhoz, amely rendkívül alkalmas olyan, elsősorban szintetikus gének kifejeztetésére, amelyek ATG transzlációs starthelyet nem tartalmaznak. Tetszőleges ilyen gének beépíthetők a plazmid egyedi Clal helyére, ha előzőleg a gén két végéhez Clal linkért kapcsolunk. Ebben az esetben — megfelelő orientációjú beépülés esetén — ágén transzlációja a Clal linker ATG szekvenciájáról indul. Ennek távolsága a lac riboszomakötőhelytől az E.coliban optimális 8 nukleotid. Természetesen a vektor ugyancsak kiválóan alkalmas saját riboszomakötőhellyel rendelkező idegen gének kifejeztetésére, melyek klónozására a polilinker régióban lévő restrikciós 'hasítóhelyek (Clal, EcoRI, BamHI, PstI, BglII, Xbal, Hindii!) kínálnak lehetőséget. (10. ábra. pER-VI/23 [-ATG] és pER-VI/23 [+ATGJ plazmidok sematikus rajza). Az egyedi expressziós vektorok elkészülése' után, a már leírt módon az Nsil hely belső 4 nukleotidját eltávolítva a génexpresszió hatásfoka tovább növekedett. Példák a pER-VI/23 alapú expressziós vektorok használatára 2. példa A találmány szerinti expressziós vektorok által biztosított hatékony génexpresszió igazolása Annak bizonyítására, hogy a találmányban leírt expressziós vektorcsalád valóban jobb hatékonyságú génexpressziót biztosít, mint az irodalomból már ismert rendszerek, direkt összehasonlítást végeztünk. A már említett „ideális“ (consensus) promoterrel (tac promoter) rendelkező pKK223— 3 expressziós vektorban (készítője J. Brosius, beszerezhető Pharmacia, Molecular Biologicals katalógus 74. oldal, kát. szám 27—4935— 01) olyan konstrukciót hoztunk létre, amely a teljes a-peptid régióban, valamint az 5’ és a 3’ nem transzlálodó régióban nukleotidra megegyezik a pER-VI/23 plazmidunk nukleotid szekvenciájával. A két plazmid azonos replikációval (Col 1) rendelkezik, így az a-peptid mennyiségében és a mRNS mennyiségében feltehetően csak a promoterek különbsége tükröződik. Nem befolyásolja az összehasonlítást a mRNS féléletidej'e, a transzláció hatékonysága stb. lévén a két mRNS nukleotidra azonos. Az összehasonlításba bevontuk a pER-VI/23 [-Nsi] plazmidot is, ahol a mRNS az előző kettőnél 4 nukleotiddal rövidebb, egyebekben teljesen azonos velük. Mind mRNS, mind a-peptid szinten végezve az összehasonlítást, azt találtuk, hogy a három expressziós vektor sorrendje pER-VI/23 [-Nsi] pER-VI/23 pKK223—3 származék, ahol minden plazmid 1,5—2-szer erősebb expressziót biztosít, mint az utána következő. 11 A következő példákban szintén modell szinten vizsgáltuk expressziós vektorainkat. 3. példa Fehérje termelés E.coliban az új vektorcsaláddal idegen gén beépítése nélkül Idegen gén beépítése nélkül maga az a-peptid (a ß-galaktozidäz N-terminális darabja) expressziója a p med Vl/23 [-Nsi] és a pL-a!fa Int/23 [-Nsij plazmidokból nem csak enzimaktivitás alapján határozható meg, hanem közvetlenül vizsgálható a keletkezett fehérje mennyisége is SDS - poliakrilamid elektroforézissel. Megfelelő lac \q — gazdatörzsben indukció nélkül nem mutatható ki a ■ß-galaktozidäz fragment termelése. YTB tápfolyadékban, 37 "C-on, logaritmikus fázisú tenyészetet 0,1—5 mM IPTG-vel indukálva megindul a génexpresszió a 6/23 [-Nsi] promoterről, és 4—8 óra alatt a baktérium összes fehérjéinek 20—60 százalékát elérő mértékben felhalmozódik a termeltetni kívánt fehérje. 4. példa Fehérje termelés E.coliban az új vektorcsaláddal idegen gén beépítése révén Annak demonstrálására, hogy expressziós vektoraink valóban univerzálisak, egyaránt alkalmasak kis és nagy fehérjék (ez utóbbiak szoktak problémát jelenteni E.coliban) termelésére, a következő kísérletet végeztük: 1. A pL-alfa Int/23 [-Nsi] Clal, PstI helyére (ahol a PstI részleges emésztéssel elértük, hogy csak egyetlen helyen hasítson az enzim) beépítettük az E.coli (klónozott) lac operonjának Clal, PstI fragmentjét, s így rekonstruáltuk a lacZ gén teljes kódoló szekvenciáját expressziós vektorunkban. A lacZ gén terméke, a ß-galaktozidüz enzim, az E.coli egyik legnagyobb méretű fehérjéje (M= = 135000). Az expressziós vektorral jelentős mértékben (összfehérje 15—30 százaléka), enzimatikusan aktív formában túltermeltethető a ß-galaktozidäz megfelelő gazdatörzsben, IPTG indukcióval. 2. Az expressziós vektor bakteriális operonként való működését két idegen bakteriális génnel vizsgáltuk. Az egyik a már említett klóramfenikol-acetil-transzferáz-gén, melyet a pBR329 plazmidból izoláltunk. A pER-VI/23 [-Nsi] PLH4 Clal helyére a pBR329 plazmidból izolált Tagi fragmentumot építettük be: Ekkor a CAT-gén a 6/23 [ Nsi] promoterről, de saját riboszomakötő helyét használva, expresszálódik az a-peptiddel közös mRNS-ről. A bakteriális fehérjéket SDS-poliakrilamid gélen vizsgálva, indukció után a két legerősebb fehérje csík az a-peptid és a CAT-fehérje. Ezt a konstrukciót átalakítottuk fúziós fehérjét expresszáló plazmiddá is. Először a poli linker régió downstream Hindin helyét kellett eltávolítani, ezt Xbal emésztést követő BAL31-es deléció képzéssel és T4 ligázzal való gyűrűzárással értük el. Ezután a két struktúrgén közötti, most már 12 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
