197358. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumorellenes anyag, valamint a fenti anyagot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
6 197358 7 Humán nekrózis faktor előállítását ismertetik az INCI J. Natl. Cancer Inst. 68(6)), 997-1003 (1982), a C.R. Searches Soc. Biol. Ser. Fil. 177(A)), 570-573 (1983) irodalmi helyeken és a 3 227 262 számú német szövetségi köztársaság beli szabadalmi leírásban. A fenti helyeken ismertetett hTNF tulajdonságai azonban eltérnek a találmány szerinti eljárással előállított hTNF-étól. A találmány tárgya tehát eljárás a humán TNF (hTNF) előállítására és tisztítására. Az eljárás a klinikai vizsgálatokban igen hasznos lehet. Több, mint 30 humán sejtvonalat vizsgáltunk szövettenyészetben, TNF-termelő képességük szempontjából. Megállapítottuk, hogy a forbol-12-mirisztát-13-acetét (PMA) jelenléte szükséges a hTNF termelés fokozásához. A PMA mint tumort elősegítő szer ismert. Jelenlegi ismereteink szerint a B-sejtvonalak, PMA-val vagy anélkül a legígéretesebb források a hTNF előállítására. A hTNF-et a fentebb ismertetett standard TNF-vizsgálati módszerekkel - azaz a tumoröló hatást az in vivo, az L-sejtekkel szembeni citosztatikus/citotoxikus hatást in vitro módszerrel - vizsgáltuk. A T-sejtek, monociták, és promyelocita sejtvonalak csak kevés TNF-et termelnek, vagy egyáltalán nem termelnek TNF-et. A találmány szerinti eljárásban sem külső eredetű BCG, sem külső eredetű endotoxin nem szükséges a hTNF előállítására. Meglepő módon a hTNF-et rekombináns vagy természetes eredetű hIFN-nel együtt alkalmazva humán tumorsejtek elpusztítására vagy gátlására, szinergetikus tumorellenes hatást tapasztaltunk. A hIFN vagy hTNF önmagában alkalmazva is tumorellenes hatást mutat, de a hTNF hatása hIFN-nel együtt alkalmazva nagyobb, mint a fenti hatóanyagok külön-külőn mért tumorellenes hatásának összege. A találmány értelmében hTNF forrásként humán sejtvonalakat használhatunk. Az egér TNF előállítási eljárása nagy mértékben függ a BCG és az endotoxin hatásától. A találmány szerinti eljárásban a humán TNF-et humán B-sejtek termelik, BCG vagy endotoxin hozzáadása nélkül. így az előállított TNF lényegében endotoxintól, valamint bakteriális és szérum szennyeződésektől mentes. Mint az 1. táblázatban látható, a vizsgált vérképző sejtek közül a B-sejtek a legjobb TNF-termelők. Az exogén BCG vagy exogén endotoxin nélküli nagymértékű TNF-termelés igen meglepő. Kis mennyiségű, vagy nyomnyi hTNF a T-sejtek, monociták vagy pro-inyelociták sejttenyészetének felülúszójában is található. In vitro L-sejt vizsgálattal (Carswell és munkatársai fentebb idézett cikke) meghatározták a humán eredetű sejtek által termelt TNF mennyiségét. Azonban először sikerült a találmány szerinti eljárással magas TNF-sziritet úgy előállítani, hogy a TNF minden exogén endotoxin szennyeződéstől mentes, mivel a tenyészethez - mint azt később ismertetjük -egyáltalán nem adunk endotoxint. Mások korábbi kísérleteikben egér TNF esetén az endotoxin jelenlétét zavarónak találták, mivel a rendszert nehéz az endotoxintól mentesíteni. Az EBV-transzformált B-sejtvonalak raelanómás betegektől származnak [Houghton és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77, 4260 (1980)]. A többi sejtvonalat a Sloan-Kettering Institute-tól, dr. Lloyd Old, dr. Jorgen E. Fogh és dr. Peter Ralph sejtbank-gyűjteményéből kaptuk. A LuklI sejteket dr. W. Stewart [Pickering és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77, 5938 (1980)] bocsátotta^ rendelkezésünkre. A vérképző humán sejtek TNF-termelésének vizsgálatára milliliterenként 5xl05 sejtet tenyésztünk 8% magzati borjúszérumot (FCS) tartalmazó RPMI 1640 táptalajban, 10 ng/ml PMA (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA) jelenlétében, vagy anélkül. Az eredményeket az 1. táblázatban adjuk meg. A 2. táblázatban ismertetjük az RPMI 1640 táptalaj összetételét. A sejteket 48 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd centrifugálással összegyűjtjük, és PMA nélküli RPMI 1640 táptalajban újraszuszpendáljuk, 1x10® sejt/ml koncentrációban. 48 óra múlva a sejttenyészeteket lecentrifugéljuk. A sejtmentes felülúszókí t -20 °C-ra hűtjük. A TNF-aktivitást a fenti felülúszókban határozzuk meg, feles hígítás itán, L-sejtes vizsgálati módszerrel. Az in vitro vizsgálatban használt NCTC 929 klón (L)-sejtvonalból származó egér L-M sejteket az American Type Culture Collection-tól szereztünk be, és Eagle-féle minimál táptalajon (MÉM) (GIBCO, Grand Island, N.Y. USA) tenyésztettük, amelyet nem-esszenciális aminoeavakkal, 100 egység/ml penicillinnel, 100 g/ml streptomicinnel és 8% hővel inaktivált nagzati borjúszérummal egészítettünk ki. A tenyésztést 37 °C-on végeztük. Az egér TNF-rezisztens L-sejtvonalat [L(R)] szenzitív L-sejtekból [ L ( S ) ] tenyésztettük ki, egér TNF-et tartalmazó táptalajba történő többszöri átoltással. A hTNF-aktivitás vizsgálatot úgy végezzük, hogy a vizsgáló lemez (24 lyukú Costar lemez) lyukaiba 0,5 ml táptalajban 50 000 tripszinezett L-sejtet mérünk, majd 3 óra múlva hozzámérünk azonos térfogatban (0,5 ml) olyan táptalajt, amely a TNF-et sorozathigitásos koncentrációban tartalmazza, és meghatározzuk 48 óra elteltével fázis-mikroszkópos vagy tripán-kék kizárásos módszerrel azt a proLein-mennyiséget, amely 50%-oz sejtpusztulást okoz. N int az 1. táblázat adataiból látható, a humán B-sejtek által termelt hTNF az egér L(S) sejtekre citotoxikus hatást fejt ki, mig az egs'r L(R) sejtekkel szemben nem citotoxikus a fentebb ismertetett standard egér TNF vizsgálatiján. A hTNF szempontjából vizsgált sejteket vagy tumor növekedést serkentő szer jelenlétében, vagy anélkül tenyészthetjük. A PMA példáid a B-sejtek hTNF-terraelését többszörösére növeli, az 1. táblázat L(S) 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
