197358. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumorellenes anyag, valamint a fenti anyagot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
4 197358 5-rezisztens L-sejtekkel [L(R)] szemben nem citotoxikus. A vizsgálatot 24 lyukú Costar lemezen végezzük. A lyukakba 50 000 tripszinezett L-sejtet tartalmazó 0,5 ml Eagle-féle minimál táptalajt mérünk, majd 2-3 óra múlva a TNF-et sorozathigitásban tartalmazó táptalajból hozzámérünk 0,5 ml-t. 48 óra elteltével fázis-mikroszkópos vagy tripán-kék festék kizárásos értékelés segítségével meghatározzuk az 50%-os sejtpusztulást okozó protein menynyiségét. Például egy standard sarzsra 1 egység részlegesen tisztított egér TNF 58 ng vagy 20 000 egység/mg specifikus aktivitású proteinnek felel meg. A fenti részlegesen tisztított egér TNF nem tartalmaz IFN-t. A tisztítás előtti eredeti szérumban még van kevés interferon (IFN). A BCG helyett indukálószerként C. granulosuraot C. parvumot, maláriát vagy Zymosan-t (élesztő sejtfal) is használhatunk. Green és munkatársai [J. Nat. Cancer Inst. 59, 1519 (1977)] szerint az egerekben az endotoxinnal szembeni maximális hiperszenzitivitás a C. parvum injektálása után hat nappal érhető el. Ennek megfelelően a fenti eljárás esetén az endotoxint 4 nappal a C. parvum beadása után adjuk az állatoknak. Az endotoxin dózisa 0,25 pg, de a TNF felszabadításának fokozására 25 mg mennyiségben használjuk. A maximális TNF-felszabadulás 1 Mg endotoxin intravénás beinjektélása után 90 perccel figyelhető meg. A TNF-termelés különböző egértörzsek esetén különböző mértékű. Jelenlegi ismereteink szerint a TNF in vivo felszabaditásáx’a a Gram-negativ baktériumokból - például E. coliból - származó endotoxinok a legalkalmasabbak [Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72, 3666 (1975)]. A TNF hatása számos tumor (egér) rendszerben megfigyelhető, közelebbi'ől az S-180 (CD-I Swiss), BP8 (C3H) szarkomákon; EL4 (C57B1/6), ASL1 (A törzs), RADA-1 (A törzs) és RL01 (BALB/c) leukémiákon; vagy P815 (DBA/2) masztocitomán. A Meth A erősen érzékeny a TNF-re abban az esetben, ha a tumort intradermálisan injektáltuk, mint azt a in vivo vizsgálatnál leírtuk. Kevésbé érzékenyek az alábbi tumorok: RCS5 (SJL) retikulum-sejt szarkoma rezisztensnek mutatkozott; a (C3H/An x I) Fi eralőtumorok csak kis mértékben érzékenyek, és az AKR spontán leukémiák közepesen érzékenyek a TNF-fel szemben. Fentiek szerint az egér TNF egér-tumorokkal szembeni terápiás hatása nyilvánvaló [Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72, 3666 (1975)]. In vitro a transzformált rágcsáló fibroblasztok (L-sejtek) szövettenyészetben sokkal érzékenyebbek voltak TNF-fel szemben, mint a Meth A szarkoma sejtek vagy az egérembrió fibroblasztok (MEF). Az élő sejtszámot 48 órás TNF-es kezelés után határoz4 zuk meg. A hatás citotoxikus és citosztatikus. de késleltetett, mivel az első 16 órában nem figyelhető meg. Az in vivo hatás Meth A sejten egy nekrotikus folyamat, amely a Meth A tumor középpontjából kiindulva kifelé terjed, és a látszólag változatlan tumorszövetből csak egy gyűrű marad vissza. A visszmaradt tumDrszövetből a tumor újra kifejlődhet. Optimális dózisú TNF-fel végzett kezelés hatására a kezelt állatok nagy százalékában teljes visszafejlődés észlelhető. Az in vitro vizsgálat alapját az L-sejtekkel végzett vizsgálatok képezik, mint azt fentebb leírtuk. Rezisztens L-sejtvonalat is kitenyésztettünk, oly módon, hogy a TNF-érzékeny L-sejteket többször átoltottuk TNF-et tartalmazó táptalajba. A TNF citotoxikus az érzékeny L-sejtekre [L(S)J, a rezisztens L-sejtekre [L(R)] azonban nem. A fenti vizsgálatokat is felhasználtuk a hTNF jellemzésére. A vizsgálatokból közvetett módon arra következtethetünk, hogy a TNF egyik sejtforrását a makrofágok képezik egér és nyúl esetén, mivel a BCG - vagy annak megfelelői - és endotoxin hatására a máj- és lépmakrofágok erőteljes szaporodásnak indulnak. Összegezve: 1) a TNF-felszabadulást indukáló szerek erőteljes makrofág-szaporodást okoznak; 2) a BCG-vel előkezelt egerekben röviddel az endotoxin beinjektélása után megfigyelhető a lép-makrofágok szelektív lizise; 3) a TNF-et tartalmazó szérum lizoszoínáüs eredetű enzim-tartalma magas, és az aktivált makrofágok jellemző módon sok lizoszomát tartalmaznak. A klónozott egér histiocitoma sejtvonalal (J774 és PU5-1,8) TNF-et termelnek; ez a termelés endotoxin hatásái-a jelentős mértékben fokozódik Mannel és munkatársai [Infect. Immun. 30, 523 (1980)] és Williamson és munkatársai nem publikált megfigyelése szerint. Az egér TNF, szérumból izolált formájában egy glikoprotein, amelynek legalább két, egy 40-60 000 és egy 150 000 molekulatömegű formája van [Mannel és munkatársai: Infect. Immun. 28, 204 (1980); Kuli és munkatársai: J. Immunoi. 126, 1279 (1981); Haranaka K. és munkatársai: Jpn J. Exp. Med. 51, 191 (1981); Green S. és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 73, 381 (1976), és nem publikált eredmények]. A TNF fagyasztott állapotban, előnyösen -70 °C alatt stabil. Aktivitásét 70 °C-on 30 perc alatt elveszti. Nyulakban 5-500 Mg/kg dózistartományban pirogén (lázkeltő) hatást fejt ki, 5 Mg/kg dózisban nem Iá '.keltő. A nyúl TNF molekulatömege irodalmi adatok szerint 39 000 és 68 000 közötti tartományban van [Ruff M.R. és munkatársai: J. Immunoi. 125, 1671 (1980); Matthews N. és munkatársai: Br. J. Cancer 42, 416 (1980); Matthews N. és munkatársai: Brit. J. Cancer 38, 302 (1978); Ostrove J.M. és munkatársai: Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 160, 354 (1979)]. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
