197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
11 197357 12 [A fibroblaszt interferon (FIF) azonban fénytöréssel rendelkező testeket képez a gazdasejt tenyészetekben.] A .gazdasejtek' kifejezés minden olyan formát átfog, amelyben a sejtek felhasználhatók kiindulási anyagként heterológ fehérje elkülönítésére. Gazdasejten értjük például - az összegyűjtött sejtpép mellett - az egész sejttenyészetet, a sejtpép egy fagyasztott mintáját vagy a sejtpép fagyasztott és felengedett mintáját. így a következő kifejezés: .a gazdasejteket pufferolt oldatban kezeljük', vonatkozhat például az egész tenyészet táptalajon történő kezelésére vagy centrifugált sejtek alkalmazására. A leírásban használt .újraaktiválás' kifejezés majdnem szinonim a .visszaessvarás', a .csavarodottság helyreállítása* kifejezésekkel, azaz arra vonatkozik, hogy biztosítjuk valamely fehérje biológiai aktivitásét az aktivitással rendelkező konformáció kialakításával. Az .újraaktiválás' nem jelenti az aminosav-szekvencia megváltoztatását, és nem foglal magába olyan jellegű aktivitást, amikor peptid elővegyületeket hasítással alakítanak aktiv formává, például tripszinogént tripszinné vagy prorennint renninné alakítanak. A .biológiai aktivitás' kifejezés a fehérje in vivo aktivitására, a szokásos in vitro és in vivo biológiai vizsgálatoknál jelentkező aktivitására, immunreakciót kiváltó képességére vagy azon képességére vonatkozik, hogy reakcióba lépjen a nativ fehérje antitestjeivel. Megjegyzendő, hogy. egyes esetekben például a fehérjék biológiailag aktivak, ha a megfelelő antitestekkel való reagálást vizsgáljuk, nem tapasztalunk azonban biológiai aktivitást a hatásvizsgálatokhoz használatos teszteknél. Tekintettel azonban arra, hogy az antitestekkel való reakcióképesség általában a legegyszerűbb és legkönnyebben kivitelezhető vizsgálati módszer, néha ezt használjuk fel az aktivitás mérésére. Az .ionerösség' a vizes oldatban fennálló ionkoncentráció szokásos mértéke. Definíció szerint ezt úgy kapjuk meg, hogy az oldatban lévő valamennyi ionra vonatkozólag összegezzük az egyes ionok koncentrációjának és töltésük négyzetének szorzatát, és az összeget elosztjuk kettővel. A .denaturáló oldat' olyan oldat, amely denaturálószert tartalmaz. A .denaturálószer' kifejezésen olyan kaotrop vegyületeket vagy anyagokat értünk, amelyek vizes oldatban és megfelelő koncentrációkban megváltoztatják a fehérjék térbeli konfigurációját vagy konformációját a fehérje felületének a megváltoztatásával, megváltoztatva például a hidratáltségot, a körülvevő oldószert vagy az oldószer és a felület közötti kölcsönhatást. Ilyen denaturálószer például a karbamid, guanidin-hidroklorid, nátriumtiocianát, továbbá mosószerek, mint a nátrium-dodecil-szulfát és a Triton. A denaturáláshoz nem használhatunk olyan erőteljes és irreverzibilis denaturáló műveleteket, mint magas hőmérséklet és erős savasság alkalmazása. Megjegyzendő, hogy a felsorolt reagensek közül némelyik erős denaturálószer, mások pedig gyengébbek, és természetesen a koncentrációjuk közvetlenül befolyásolja a detaturálószer erősségét és hatékonyságát. Ken< húzhatunk pontos választóvonalat az erős denaturálószerek és a gyenge denaturálószerek között, azonban az erős denaturáló viszonyok tökéletesebben .kiegyenesítik ' a fehérjét, bármilyen volt is a konformációja, amelyet fiziológiás körülmények között a hidrofil és hidrofób részeket tartalmazó aminosav-szekvencia határoz meg. A leggyakrabban használt erősen denaturáló oldat, amellyel a fénytöréssel rendelkező fehérje feloldható, az ionos denaturálószer, a guanidin-hidroklorid eléggé koncentrált (4-9 M) oldata. A karbamid a gyenge denaturálószer leggyakrabban használt példája, mivel még elég nagy (például 7 M) koncentrációja alkalmazásakor is visszamaradnak egyes másodlagos fehérjeszerkezetek, és lehetőséget ad a .nativ konformáció kialakítására. Emellett nemionos jellegű, és ez fontos a találmány szerinti eljárás olyan foganatositási módjánál, amelynél ioncserélő módszereket alkalmazunk. Ennek megfelelően az .erősen denaturáló’ oldat olyan oldat, amely hatékonyan .kiegyenesíti ' azt a fehérjét, amely szintén oldva van az oldatban. A .kiegyenesedés' viszonylag kiterjedt lesz, azonban reverzibilis. Az ilyen mértékű kiegyenesítést biztosító oldott anyagokra példa a guanidin-hidroklorid és a nátriumtiocianát, rendszerint viszonylag koncentrált - 4-9 M körüli - oldatban, és megemlíthetők a mosószerek, rendszerint 0,01-2% töménységben. A .gyengén denaturáló' oldatok olyan oldatok, amelyek lehetővé teszik, hogy a fehérje legalább is részben felvegye azt a térbeli konformációt, amelyben aktív alakjában található endogén vagy homológ fiziológiás körülmények között. Emellett a gyengén denaturáló oldatok szolubilizálják a fehérjének azokat az esetleges átmeneti formáit, amelyek az erősen denaturáló oldatban megtalálható denaturált alak és a megfelelően csavarodott konformáció között lehetnek. Példaként ezekre a gyengén denaturáló oldatokra megemlíthetjük a tömény - általában 4-9 M koncentrációjú - karbamid-oldatokat, és azoknak a fentebb felsorolt denaturáiószereknek a híg oldatait, amelyek nagyobb koncentrációban erősen denaturálnak. Ez utóbbi híg oldatok koncentrációja rendszerint 0,5-2 M. Egyes esetekben azonban a gyengén denaturáló oldat funkcionális állapota standard enzimvizsgálati körülmények között is megfigyelhető, például kis - 0,1 M 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
