197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
13 197357 14 vagy még kisebb - pufferkoncentrációknál és fiziológiás pH-értéknél. A leírásban a .gyengén denaturáló oldat* kifejezést a funkcionális definíció szerint értelmezzük) azaz olyan oldatokra értjük) amelyek lehetővé teszik a visszacsavarodást a fehérje bármilyen deformált konformációjából - a feltevésünk szerint közbenső termékeken keresztül, amelyek ebben az oldatban oldódnak - egy olyan konformációba, amely biztosítja a fehérje biológiai aktivitását. A leírásban szerepeltetünk olyan rövidítéseket és kifejezéseket, amelyeket bizonyos módszerekkel kapcsolatban szokásosan használnak. Ezeket az alábbiakban röviden ismertetjük: A gélpermeációs kromatográfia vagy gélszűrés szokásosan használt tisztítási módszer, amely a méretük szerint tesz különbséget a molekulák között. Az ehhez használt anyagot gyakran molekulaszitának is nevezik. A gél alkalmas megválasztásával szinte bármilyen mérettartomány elérhető. Azok a molekulák, amelyek eléggé nagyok ahhoz, hogy a gél pórusain kívül maradjanak, akadálytalanul mennek át a gélt tartalmazó oszlopon. A kisebb molekulákat az oszlop frakcionálja. Az SDS-PAGE nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében kivitelezett poliakrilamid-gélelektroforézis, amely szokásosan alkalmazott módszer, s lehetővé teszi a hozzávetőleges molekulatömeg és a tisztaság meghatározását. Ennél a módszernél a fehérjét elektroforézisnek vetjük alá redukáló körülmények között, detergens jelenlétébe. Egy adott molekula esetén a vándorlás mértéke csak a molekulatömegtől függ, amelyet diszulfidkötések távollétében határozunk meg, mivel a vizsgálatot redukáló körülmények között végezzük. Ezért a készítményben jelenlevő egy adott fehérje mennyiségét úgy határozhatjuk meg, hogy denzitometriásan mérjük a fehérje molekulatömegének megfelelő helyen megjelenő, megfestett sávot. Ezt a módszert részletesen ismerteti a következő szakirodalmi hely: Laemmli, U.K. és munkatársai, Nature, 227, 680 (1970). A .Western Biot' kifejezés egy, az antitestre specifikus megkötési módszerre vonatkozik, ahol a mérni kívánt fehérjét tartalmazó oldattal vagy szuszpenzióval nitrocellulóz szűrőt kezelünk, majd a szűrőt átitatjuk az illető fehérje izotóppal jelzett antiszérumával. A kívánt fehérje jelenlétét az bizonyítja, hogy az izotóp a szűrőn marad annak következtében, hogy az illető fehérjével lejátszódott reakció folytán az antitest oldhatatlanná vált. A módszert részletesen ismerteti a következő szakcikk: Towbin, H. és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. (USA), 76, 4350 (1979). A .kromatográfiás ioncserés fehérjetisztitási módszerek’ kifejezés olyan eljárásokra vonatkozik, amelyeknél az anyagot kromatográfiás elválasztásnak vetik alá ioncserélő oszlopon lejátszódó kölcsönhatás alapján. Gyakran alkalmazott oszlopok a következők: DEAE-cellulóz, amelynek a jelölése gyakran egyszerűen DEAE, például DE-52 vagy DEfc-53 kereskedelmi nevű termékek, vagy a karboxi-metil-cellulóz (CMC). Megfelelő pH-értéknél a DEAE-tartalmú oszlop ioncserélőként viselkedik, és negativ töltésű részecskék kötődnek az oszlophoz. Az elúció ezekről az oszlopokról az eluáló oldószerek alkotórészeinek megváltoztatásával történhet, vagy az oldat pH-értékének, ionerősségének vagy dielektromos állandójának megváltoztatásával, sőt, akár a hőmérséklet szabályozásával. A .puffercsere' olyan módszerekre vonatkozik, amelyeknél megváltoztatjuk a tényleges .oldószert', azaz a makromolekula cseppfolyós környezetét. Ebben az értelemben tehát az .oldószer' ténylegesen magában foglalja annak a közegnek a kismolekulájú oldott anyagait is (például a sókat), amelyben a kívánt makromolekula található, mivel ez utóbbi oldhatósága valóban azoknak tulajdonítható. A találmány szerinti eljárásnál a kívánt fehérjét például úgy készíthetjük elő ioncserélő kromatográfiához, hogy megfelelő pufferben 8 M karbamidot tartalmazó oldószert biztosítunk, és ezzel helyettesítjük például a 7 M koncentrációjú guanidin-hidrokloridot, amelyet a találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatositási módja értelmében denaturálószerként használunk. E .puffercsere' kivitelezéséhez az egyik alkalmas módszer a dialízis, amelynél a fehérjét tartalmazó 7 M guanidin-hidroklorid oldatot dializáljuk a karbamid-tartalmú pufferoldat lényegesen nagyobb mennyiségével szemben. A puffercserét azonban más módszerekkel is végezhetjük, például gélpermeációval és diaszűréssel. B. A találmány általános ismertetése Az 1. folyamatábrán mutatjuk be általánosságban a találmány szerinti eljárást, amikor a kívánt aktív fehérjét elkülönítjük azoktól a gazdasejtektől, amelyekben ez a fehérje képződött és fénytöréssel rendelkező testek alakjában kivált. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8
