197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
9 197357 10 következők: méret szerinti szétválasztás gélpermeációs kromatográf iával, és a nem kívánt fehérjék eltávolítása ioncserélő gyantán történő differenciális adszorpcióval. Ez a tisztító eljárás általánosan alkalmazható a gazdasejttenyészetekben kicsapott heterológ fehérjékre, függetlenül azok biológiai típusától, és ez azzal az előnnyel jár, hogy bármilyen termék esetén azonos felszerelés használható. Ez a találmány szerinti eljárás általánosan alkalmazható, legfeljebb csekély mértékű módosításokra vagy beállításokra van szükség az egyes fehérjéknél. A találmány tárgyát képező eljárásváltozatok alkalmas kombinációja és kiválasztása megoldást nyújt a fénytöréssel rendelkező testekből álló fehérjével kapcsolatos problémákra. Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat. Az 1. ábra urokinázt (UK) tartalmazó összekapcsolt fehérjét termelő Escherichia coli sejtek fáziskontraszt mikroszkóp alatti képét mutatja. A 2. ábrán üledék-szuszpenzió látható, szintén fáziskontraszt mikroszkóp alatt. Az üledéket a fenti sejtek elbontásával és kis sebességű centrifugálásával kaptuk. A 3. ábra sertés növekedési hormon, veszettség antigén és urokináz nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézisének eredményeit mutatja be. Az ábrán összehasonlítjuk az ultrahanggal kezelt nyers sejtek szennyezöanyag-tartalmát a találmány szerinti eljárással előállított, elkülönített, fénytöréssel rendelkező testek szennyezéseivel. A 4A. ábra Escherichia coli tenyészetből elkülönített emberi növekedési hormon részlegesen elkülönített, fénytöréssel rendelkező testjeinek fényképe. A 4B. ábra nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamid-gélelektroforézis utáni gél fényképe, amelyen az elbontott sejtet és a fénytöréssel rendelkező testekből álló fehérjét hasonlítjuk össze mind élő, mind pedig elölt sejtek esetében. Az 5A. ábra serés növekedési hormonokból álló, fénytöréssel rendelkező testeket tartalmazó Escherichia coli egész sejtek fényképe. Az 5B. ábra az %A. ábrán bemutatott készítmény ultrahanggal végzett kezelése utáni fényképe. Az 5C. ábra a centrifugálással kapott szemcse fényképe, amikor az 5B. ábrán látható, ultrahanggal kezelt szuszpenziót kis sebességgel centrifugáltuk. A 6. ábrán elölt és nem-elölt sejtek centrifugálásával kapott felülúszó folyadék és szemcse nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamid-gélelektroforézisének eredményeit szemlélteti. A következőkben részletesen ismertetjük a találmányt: A. Definíciók A .heterológ' fehérjék olyan fehérjék, amelyeket a gazdasejt normális körülmények között vagy egyáltalán nem termel, vagy csak korlátozott mennyiségben termel. A DNS-re kombinációs technológia és más génmanipulációs módszerek, például a pont rautagenézis, lehetővé tette a heterológ fehérjék nagyobb mennyiségekben történő termelését átfertőzött gazdasejtek tenyészeteiben. A gyakorlatban ezeket a heterológ fehérjéket gyakran genetikai úton termelik, és kicsapásuk olyan körülmények között történik, amikor fennmarad a gazdasejtfehérjék oldhatósága. Egyes esetekben a termelt fehérje oldhatatlansága olyan mértékű, hogy ezek a fehérjék úgynevezett .fénytöréssel rendelkező testek' alakjában vannak jelen a gazdasejtben, azaz olyan testekként, amelyek megtörik a fényt és fényes foltokként jelennek meg, ha fáziskontraszt mikroszkópon keresztül nézzük őket. Ezért ezeket a fehérjéket gyakran .fénytöréssel rendelkező fehérjék' vagy .fénytöréssel rendelkező testekből álló fehérjék' elnevezéssel említik. A találmány tárgyát olyan eljárások képezik, amelyek felhasználhatók a gazdasejtekben fénytöréssel rendelkező testek alakjában megjelenő fehérjék elkülönítésére, tisztítására és kívánt esetben újraaktiválására. A találmány részben olyan eljárásokra is irányul, amelyek elősegítik ezeknek a fénytöréssel rendelkező testeknek a képződését; a fehérje találmány szerinti kinyerése és aktiválása azonban kifejezetten ezekre a fénytöréssel rendelkező fehérjékre alkalmazható. A jelen leírásban a .fénytöréssel rendelkező', .kívánt' és .heterológ" kifejezéseket egymással felcserélhető kifejezésekként használhatjuk olyan fehérje megjelölésére, amelyet valamely idegen gazdasejt termelt, és amely az előállítás vagy tisztítás valamelyik szakaszában csapadékként látható fáziskontraszt mikroszkóp alatt, függetlenül attól, hogy az említés időpontjában milyen a fehérje fizikai állapota. Egyes esetekben például azután is fénytöréssel rendelkező fehérjéről beszélünk, hogy az illető fehérjét oldhatóvá alakítottuk a találmány szerinti eljárással. A bakteriális eredetű gazdasejtekben termelt különféle heterológ fehérjék, például a sertés növekedési hormon, az emberi növekedési hormon és a vírusbevonó fehérjék, így a száj- és körömfájás vírussal, fehérjével és HBsAg-vel összekapcsolt fehérje, fénytöréssel rendelkező testeket képeznek kisebb vagy nagyobb mértékben a tenyészetekben szokásosan alkalmazott körülmények között. Egyes más fehérjék, például az immun interferon (IIF) és a leukocita interferon (LelF) jobban oldódnak a citoplazmában. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
