197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
7 197357 8 tisztítására szolgáló további műveletekkel, azaz amikor megszabadulunk azoktól a kisebb mennyiségű szennyező anyagoktól, amelyet a fehérje a centrifugálással kapott szemcséből való egyszerű kioldás után tartalmaz. A jelen bejelentésben ismertetett találmány Így eredményesen biztosítja a heterológ fehérjék előállítását. Egyrészt a találmány tárgya eljárás a fénytöréssel rendelkező fehérje elkülönítésére a gazdasejt fehérjéjétől, amikor is a gazdasejtek szuszpenzióját elbontjuk és kis sebességű centrifugálással kinyerjük a fénytöréssel rendelkező testeket. Ennek a tisztító műveletnek a lefolyásét célszerűen úgy követhetjük, hogy mikroszkóp alatt vizsgáljuk a készítményt, és megállapítjuk a bakteriális eredetű sejtek, sejttöredékek vagy sejtfaltöredékek jelenlétét vagy távollétét. Másrészt, a találmány tárgya eljárás a fénytöréssel rendelkező testek alakjában kicsapott heterológ fehérjék mennyiségének növelésére a fénytöréssel rendelkező testek elkülönítése előtt. Az eljárás során a gazdasejttenyészet szuszpenzióját elpusztító behatásnak tesszük ki, például nagy koncentrációjú savval, hővel vagy kis koncentrációban vett szerves apoláros oldószerrel kezeljük. Ez az .elpusztító' kezelés a heterológ fehérje további kicsapását eredményezi. Utána olyan műveleteket végzünk, amelyek szintén a találmány körébe tartoznak, és a megnövelt mennyiségű kicsapott fehérje kinyerését célozzék. Harmadrészt, a találmány tárgya eljárás a fénytöréssel rendelkező fehérje felhasználható alakban történő kinyerésére, erősen denaturáló oldatban végzett szolubilizálással. Ennél az eljárásnál kívánt esetben a gazdasejtek szuszpenzióját a fénytöréssel rendelkező fehérje kinyerése előtt olyan pufferoldattal kezeljük, amelynek az ionerőssége megfelelő a gazdasejt fehérjéjének a szolubílizálására. Negyedrészt, a találmány tárgya eljárás az előzetesen erősen denaturáló oldatban szolubilizált, fénytöréssel rendelkező fehérje további tisztításra, előnyösen redukálószer jelenlétében. Ennek során eltávolítjuk a nagy molekulatömegű szennyező anyagokat vagy molekulaszitával vagy pedig nagy sebességű centrif u gálással. Szintén a találmány körébe tartoznak azok a műveletek, amelyekkel felhasználjuk vagy tovább tisztítjuk a már erősen denaturáló oldatban oldott heterológ fehérjét oly módon, hogy a denaturáló közeget vagy hígítással gyengítjük, vagy gyenge denaturálószerrel váltjuk fel, s az oldatnak ezt a módosítását adott esetben redukálószer jelenlétében végezzük. A gyenge denaturáló körülmények között a fehérje konformációja is átalakulhat, amit egyes esetekben a redukálószer is elősegít. A gyenge denaturálószer további előnye, hogy további tisztító és/vagy újranaturáló műveleteket tesz lehetővé; erősen denaturáló közegben ugyanis ezek nem vezetnének eredményre. Az erősen denaturáló közeget úgy alakíthatjuk át gyengén denaturáló közegre, hogy puffercserét végzünk olyan, hasonló koncentrációjú denaturálószerrel, amelynek a kaotróp tulajdonságai gyengébbek (például a guanidint karbamiddal váltjuk fel), vagy pedig - ha a jelenlevő fehérje oldhatósági jellemzői lehetővé teszik - hígítással csökkentjük ugyanannak az erős denaturálószernek a koncentrációját. Szintén a találmány tárgyát képezi egy specifikus reaktiváló eljárás, amelyet gyengén denaturáló közegben vitelezünk ki. Ennél az eljárásnál az erősen denaturáló oldatban szolubilizált, fénytöréssel rendelkező fehérjét enyhe oxidálószerrel kezeljük szulfition jelenlétében. A kezelés sorén a cisztein és a cisztintartalmú fehérjék fehérje-S-szulfonátokká alakulnak ét. Az erősen denaturáló oldatot ezután gyengítjük, hogy lehetővé tegyük a konformáció átalakulását, majd ismét kialakítjuk a diszulfidkötéseket valamely szuifhidril vegyület, például béta-merkapto-etanol vagy redukált glutation alkalmazásával, a megfelelő diszulfid (oxidált) alak jelenlétében. Szintén a találmány értelmében további kezelésnek vetjük alá az erős denaturálószerben szolubilizált fehérjét a konformáció átalakítása érdekében oly módon, hogy az erős denaturálószert gyenge denaturálószerre] cseréljük ki, és az oldatot egy olyan keverékkel kezeljük, amely túlnyomórészt valamely szulfidril vegyületból, kisebb mennyiségben pedig annak diszulfid formájából áll. így egy lépésben alakítjuk ét a konformációt .redox puffer'-ben. A találmány tárgyát továbbá tisztító eljárások képezik, amelyek redukálószer, például béta-merkapto-etanol jelenlétében vitelezzük ki, majd dialízissel vagy más alkalmas módon eltávolítjuk a denaturálószert és a redukálószert. Ha nem törekszünk a levegő kizárására, akkor az újraoxidálja a fehérjét, és így ismét kialakulnak a diszulfid-kötések, amelyek képződését gátolta a redukálószer jelenléte. A találmány továbbá egy többlépéses eljárásra vonatkozik, amelynek célja a gazdasejt tenyészetében kicsapott heterológ fehérjék tisztítása, és amelynek értelmében megfelelő sókoncentrációjú és pH-értékű oldattal eltávolítjuk az oldható gazdasejtfehérjéket, majd redukálószert tartalmazó denaturáló oldatban szolubilizáljuk a kicsapott heterológ fehérjét, végül a denatutáló oldatból kinyerjük a kívánt fehérjét újranaturált alakban. Adott esetben a kívánt fehérjét további tisztítási műveletnek vethetjük alá, amelyek önmagukban ismert módszerek lehetnek, kivitelezésük azonban redukálószer jelenlétében történik. Ilyen tisztító műveletek például a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
