197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
41 197357 42 A száj- és körömfájás vírusát bevonó fehérje A száj- és körömfájás vírusantigén különböző törzseinek megfelelő rekombinált DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 W3110/pFMG (01), W3110/pFMB (A24), W3110/FMD (03), W3110/FMC (A27) törzseket (amelyeket a 374 855 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, a 68 693 sz. európai és a 2 103 622 sz. angol szabadalmi leirés ir le, a bejelentés napja 1982. május 4.) tenyésztettünk, a sejteket összegyűjtöttük, és a fénytöréssel rendelkező részecskéket elkülönítettük az 1. példában ismertetett módon. A fénytöréssel rendelkező részecskékben jelenlevő fehérjének körülbelül 50%-a volt klónozott száj- és körömfájás virusbevonat-fehérje gén termék, amint azt a 2- -merkapto-etanol és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézis eredményeinek denzitométeres kiértékelése és a .Western biot" vizsgálat mutatta. 8. példa 9. példa A fénytöréssel rendelkező fehérje menynyiségének növelése a sejtek elpusztításával Meghatároztuk az emberi növekedési hormon mennyiségét a citoplazmában és a fénytöréssel rendelkező testekben az elölt és elöletlen sejteken végzett összehasonlító vizsgálattal. Az emberi növekedési hormon termelésére képes Escherichia coli K-12 W3110/pl07 törzs setjeit (lásd a 2. példa) tenyésztettük, majd pedig centrifugálással öszszegyűjtöttük az 1. példa A. pontjában ismertetett módon. A centrifugálás előtt a táptalajt két részre osztottuk. Az egyik részt 0,25% fenollal és 0,25% toluollal kezeltük, és 37 °C-on 4 órán át inkubáltuk. Az ilyen módon elpusztított sejtek jelölése .PT‘, míg az elöletlen sejteké .NPT'. A. A teljes sejtfehérje extrakciója nátrium-dodecil-szulfáttal Az elölt és az elöletlen sejtek egyenlő mintáit azonos kezelésnek vetettük alá: mindegyik sejtmintát megbontottuk ultrahanggal végzett kezeléssel egy olyan oldatban, amely 5 ml 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, 10 raM etilén-diamin-tetraecetsavat és 250 /ul 20%-os nátrium-dodecil-szulfát-oldatot tartalmaz. A szuszpenziókat 0,5 percig kevertük, majd centrifugáltuk. A felülúszó folyadékokban meghatároztuk az emberi növekedési hormont radioaktív immunvizsgálattal (RIA) és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézissel. Mind az elölt, mind pedig az elöletlen sejtek aktivitása lényegében azonos volt a radioaktiv immunvizsgálattal, mégpedig 8,3x10s illetve 8,7x10®. Feltehetően a nátrium-dodecil-szulfáttal végzett extrakcióval mind az eredetileg oldható, mind az eredetileg oldhatatlan emberi növekedési hormont kinyerjük. A 6. ábrán mutatjuk be a nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézissel kapott megfelelő eredményeket, valamint a kővetkező, B. pont szerint kezelt mintákkal kapott gélelektroforézis eredményeket. B. Kísérleti exti-aktumok Az elölt és elöletlen sejtek két további egyenlő mintáját azonos módon kezeltük: 5 ml 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-oldattal (amely 10 mM etilén-diamin-tetraecetsavat is tartalmazott) extraháltuk és 0,5 percig kevertük. A szuszpenziókat ezután 10 percig centrifugáltuk a gravitációs gyorsulás 10 000-szerese mellett, azaz kis sebességgel, majd a felülúszó folyadékot és az üledéket külön-külön vizsgáltuk. Feltehetően az üledékben lévő fehérje oldhatatlan nátrium-dodecil-szulfát távollétében. Az elöletlen sejtek aktivitása a felülúszó folyadékban 4,6x10® egység/ml volt (körülbelül fele a nátrium-dodecil-szulfátos extraktuménak), az üledékben azonban lényegesen kevesebb, 0,42x10* egység/ml. Másrészt az elölt sejteknél az emberi növekedési hormon aktivitása lényegesen kisebb volt a felülúszó folyadékban a nátrium-dodecil-szulfátos extraktuméhoz képest, a radioaktív imniunvizsgálat alapján O^öxlO4 egység/ml, és csekély volt a szemcsében is az aktivitás, mivel a szemcse szolubilizációja bekövetkezett. Hasonló eredményeket kapunk akkor is, amikor a mintákat hasonló módon kezeltük és 30 percig nagyobb sebességgel centrifugáltuk, azaz a gravitációs gyorsulás 35 000-szerese mellett. C. Az eredmények összehasonlítása A 6. ábrán foglaljuk össze a nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézissel kapott eredményeket. Az ábra 12. oszlopa tiszta emberi növekedési hormon mintára vonatkozik. A 9. illetve 10. oszlop elöletlen egész sejtek illetve elölt egész sejtek nátrium-dodecil-szulfátos extraktumának felelnek meg. Mintegyik esetben fehérjekeverék mutatható ki, az emberi növekedési hormonnak megfelelő erős sávval. Az 1. és az 5. oszlop az elöletlen sejtek kis sebességű illetve nagy sebességű centrifugálásával nyert felülúszó folyadék sávjait mutatja. A 3. és a 7. oszlopban az elölt sejtek kis sebességű illetve nagy sebességű centrifugálásával előállított felülúszó folyadék 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 22
