197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
21 197357 22 gokra is szükség lehet, például kelátképzőkre, mint amilyen az etilén-diamin-tetraecetsav. Amint azt a fénytöréssel rendelkező testek alakjában jelenlevő fehérjék viselkedése mutatja az 1-8., 10. és 11. példában, azok az oldatok, amelyek nem erősen denaturálok, általában nem oldják ezeket a fénytöréssel rendelkező fehérjéket (ugyanakkor a gazdasejtek fehérjéi oldódnak bennük). Az erős denaturáló oldatok viszont oldják a fénytöréssel rendelkező fehérjéket. Ennek megfelelően a gyengén denaturáló pufferoldatok szintén felhasználhatók a gazdasejtek fehérjéinek szolubilizálására és eltávolítására. A találmány szerinti eljárás e változata értelmében a gazdasejteket először olyan közegben szuszpendáljuk, amelynek az ionerőssége megfelelő ahhoz, hogy sok gazdasejtfehérjét szolubilizáljon, azaz az ionerőssége 0,01-2 M, előnyösen 0,4-0,6 M, 5-9 közötti, előnyösen 6-8 közötti pH-értéken. Pontos ionerősség- és pH-értékeket természetesen nem adhatunk meg, az alkalmazható értéktartományok a fentiek. A fenti oldat jelenlétében bekövetkezik a sejtek megbontása, majd a szuszpenziót centrifugáljuk. Az Így képződő üledék elsősorban a fénytöréssel rendelkező alakban lévő, kívánt fehérjéket tartalmazza, amelyeket a fentebb leírt, erősen denaturáló közegben szolubilizáljuk. A 6zolubilizált fehérjét az újranaturálását lehetővé tevő módon nyerjük ki. P. A nagy molekulatömegű szennyező anyagok eltávolítása A találmány egy olyan eljárásra is kiterjed, amelynek értelmében a szolubilizált, kívánt, korábban fénytöréssel rendelkező fehérjét közvetlenül az erősen denaturáló oldatban megszabadítjuk a nagyobb molekulatömegű komponensektől, még akkor is, ha a denaturálószer ionos, molekulaszita vagy nagy sebességű centrifugálás alkalmazásával. A szükséges műveleteket az 1. folyamatábrán a .felülúszó folyadék, a kivánt fehérjével" megjelölésű anyag feldolgozására feltüntetett, legbaloldalibb nyilak mutatják. Az erős denaturálószerrel extrahált szemcse centrifugálásával nyert felülúszó folyadékot vagy méret szerint megkülönböztetető gélpermeációs molekulaszitával töltött oszlopon vezetjük át (ilyen molekulaszita például a szefakril), vagy nagy segbességgel centrifugáljuk, hogy elkülönítsük a nagyobb molekulasúlyú alkotórészeket. Egyik módszernél sincs szükség arra, hogy az ionokat eltávolitsuk az oldatból, ezért közvetlenül felhasználhatjuk a szemcse extraktumát, még akkor is, ha ez az extraktum ionos. (Lásd a 10. és 11. példát). Amikor a nagy molekulatömegű szennyező anyagokat gélszűréssel távolítjuk el, a molekulaszitát, például Sephacryl S-300-at tartalmazó oszlopot egyensúlyba hozzuk egy alkalmas pufferrel, amely előnyösen redukálószert is tartalmaz, és átvezetjük az oszlopon a heterológ fehérjét tartalmazó oldatot. Az oszlopról távozó folyadékot, amely tartalmazza a nagyobb molekulatömegű anyagokat, elöntjük, a heterológ fehérjét pedig további pufferoldattal eluáljuk. Az eluált fehérjét például oly módon ellenőrizhetjük, hogy mérjük az optikai sűrűséget 280 nm-nél, a kívánt fehérje jelenlétét nemionos oldószerrel szemben kivitelezett dialízissel igazolhatjuk. Ezután nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében kivitelezett poliakrilamid-gélelektroforézissel határozhatjuk meg a megfelelő molekulatőmegű fehérjét. Az alternatív módszernél nagyegbes6égű centrifugálást végzünk a gravitációs-gyorsulás 25 000-40 000-szerese, előnyösen 35 000- -szerese mellett, 10 perc és 3 óra közötti ideig, majd a felülúszó folyadékot további tisztítás céljából elkülönítjük. Eléggé szokatlan, ha egy ipari fehérjetisztitó eljárásnál első kromatográfiás lépésként gélpermeációs kromatográfíát alkalmazunk, azaz például ioncserélő kromatográfia előtt végezzük a gélperraeációt. A találmány szerinti eljárásnál azonban a fehérje eléggé tiszta (gyakorlatilag mindig legalább 50%-os tisztaságú) közvetlenül elbontás és/vagy denaturálás után. Ezért a fehérjék elkülönítésére szolgáló szokásos eljárásokkal összehasonlítva, a kivánt fehérje eléggé tiszta állapotban van már, amikor a gélszüréses lépés következik. Ennek következtében erre az esetre - nem vonatkozik a szokásos hátrány, azaz a gélszűrés kisebb kapacitása az ioncsere kapacitásához képest. Mivel a szennyéző anyagok mennyisége csekély, nincs szükség olyan nagy kapacitásra, mint amikor kis mennyiségű értékes fehérjét különitünk el sokféle szennyező anyagtól. Kivánt esetben ezután további tisztítást is végezhetünk. Ha a feloldáshoz használt denaturálószer ionos volt, BzükBég van az oldat sómentesitésére abban az esetben, ha a további tisztítás ioncserével történik. Ennél a sómentesitésnél az ionos denaturálószert nem ionos denaturálószerre cseréljük ki. A gyakorlatban előnyös, ha erre a célra gyengén denaturáló oldatot, például karbamid-oldatot használunk. Jóllehet elvben a denaturálószert egyszerűen például dialízissel távolíthatjuk szokásos pufferek alkalmazásával, ez gyakran a fehérje újbóli kicsapódását eredményezi. A fehérje korai kicsapódását megakadályozzuk, ha olyan oldatban tartjuk, amely tartalmaz bizonyos mennyiségű denaturálószert. Miután az ionokat eltávolítottuk és nem ionos anyaggal helyettesítettük, sokféle kromatográfiás módszert alkalmazhatunk a to-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
