197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
23 197357 24 vàbbi tisztításhoz, így ioncserét vagy semleges adszorbenseket. Előnyös választás ezek közül a DEAE cellulóz kromatográfia olyan pH-értéken, amelyen a kivánt fehérje nem tapad az oszlophoz, és megjelenik az oszlopról távozó folyadékban. Ilyen módon az oszlop visszatartja a fehérje anionos szennyező anyagait, és eltávolítja azokat a kivánt fehérjétől. A fordított eljáráshoz képest, amelynél a kívánt fehérje adszorbeálódik és utána eluáljuk, ennek a módszernek nyilvánvaló előnye, hogy egyszerű és kevesebb gyantát igényel. Tekintettel arra, hogy a kivánt fehérje van jelen túlnyomórészt, csak annyi gyantára van szükség, amennyi adszorbeálja a szennyező anyagokat. A találmány szerinti eljárásnak ez a változata azonban nem korlátozódik bizonyos példákra, hanem lehetővé teszi, hogy sokféle elválasztási módszert alkalmazzunk a további tisztításhoz. G. Az oldhatóság fenntartása erős denaturálószer nélkül A találmány arra a megoldásra is kiterjed, amelynél a tisztítás folyamán fenntartjuk a fehérje oldhatóságát oly módon, hogy a fehérje erősen denaturáló oldatát gyengén denaturáló oldattal helyettesítjük a tisztítás vagy a biológiai vizsgálat előtt. Egyes esetekben, például az Escherichia coli által termelt emberi növekedési hormonnál ez önmagában elegendő lehet a visszacsavarás eléréséhez, azonban ez nincs mindig így. Továbbá némelykor és bizonyos alkalmazásoknál (például ahol később nem alkalmazunk ioncserét), az erősen denaturáló oldat korlátozott mértékű hígítása elegendő a fehérje oldhatóságénak fenntartásához. A puffercsere azonban, amelynél az erősen denaturáló oldatot gyengébbel váltjuk fel, hasznos az oldhatóság fenntartásához, miközben lehetőség van a további tisztításra és egyes esetekben a biológiai aktivitás helyreállítására. Ez főképpen az erős ionos denaturélószerek esetén kívánatos, mivel például gyakran szükség van ioncserélő módszerek használatára ahhoz, hogy tovább tisztítsuk a részlegesen tisztított, fénytöréssel rendelkező fehérjéket. A fénytöréssel rendelkező fehérjék szolubilizálásával nyert oldatot közvetlenül nem használhatjuk ehhez, mivel az ionos denaturálószer zavarja az ioncserét. A denaturálószer eltávolítása azonban gyakran a kivánt fehérje kicsapását eredményezi. Ezek a problémák elkerülhetők puffercserével, araikor az erős ionos denaturálószert, például a guanidint, kevésbé erős nem ionos denaturálószerrel, például karbamiddal váltjuk fel. Úgy tűnik, hogy a karbamid észszerű koncentrációkban - azaz 1-9 M koncentrációban - lehetővé teszi a fehérjék konformációjának visszaállítását a természetes állapotukat megközelítő állapotba, akár extrahált, akár S-szulfonált alakban voltak, és emellett (talán ennek következtében) megmarad a fehérjék oldhatósága. A puffercserét kivitelezhetjük béta-merkapto-etanol vagy más alkalmas redukálószer jelenlétében, úgy, hogy redukáljuk az esetleges nem megfelelő diszulfidkötést, amely kialakulhatott a puffercserével kiváltott újranaturálás előtt, vagy alternatív módon az S-szulfonát alakjában levő fehérjét. Ennek megfelelően, ennél a találmány szerinti eljárásnál a fehérjét vagy S-szulfonátját és például 4-9 M guanidin-hidrokloridot tartalmazó, erősen denaturáló oldatot puffercserének vetjük alá dialízis vagy diaszűrés alkalmazásával karbamid-oldattal vagy más gyenge denaturálószer oldatával szemben, amely adott esetben redukálószert is tartalmaz alkalmas koncentrációban. A puffercserét a későbbi tisztító műveletek előtt végezzük el. (Amint azt a leírás más helyén kifejtjük, az eredeti, erősen denaturáló oldatot először szulfittal és enyhe oxidálószerrel kezelhetjük, hogy szulfitolizis menjen végbe, mielőtt puffercserét végeznénk gyengén denaturáló közeggel szemben. Ez a szulfitolizis beilleszthető a találmány szerinti eljárás jelen változatába.) Mindegyik esetben a gyengén denaturáló oldat olyan fehérjét tartalmaz, amelynek csavarodottsága közelebb áll a biológiailag aktiv fehérjének megfelelő alakhoz (akár S-szulfonálva van, akár nem), és a kapott oldat alávethető a tisztító módszerek teljes skálájának, például anioncserélö oszlopon, Így DEAE-cellulóz oszlopon, vagy kationcserélö oszlopon, például karboxi-metil-cellulóz oszlopon végzett ioncserének. A későbbi tisztitó műveleteket mindig önmagában ismert módon végezzük, megfelelő pH-értéken és sókoncentrációnál, az elkülöníteni kivánt fehérjétől és az alkalmazott stratégiától függően. Ezek a tisztító műveletek a szakember számára ismertek, és alkalmazásuk nem jelent problémát. H. A konformáció kialakítása (visszacsavarás) A találmány szerinti eljárás további három változata három alternatív eljárás, amely a kivánt fehérje (feltehetően a helytelen konformációja miatt) inaktiv alakjának újraaktiválására irányul. Az első ilyen eljárásnál a fénytöréssel rendelkező fehérjéket, amelyeket erős denaturálószer, például guanidin-hidroklorid oldatával szolubilizáltunk, újranaturáljuk a következőképpen: először szulfitolizist végzünk az erősen denaturáló oldatban, majd visszacsavarás, a szulfonát eltávolítása és diszulfid-képződés következik gyengén denaturáló közegben, valamely szulfhidril vegyület és az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
