197355. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szignálszekvencia előállítására proteinek transzportjára, expressziós rendszerekben

10

197355

11

'csatlakozóan) a teljes majom-preproinzulin információt tartalmazó pUC 9 plazmidból nyerjük MbO II/Sma I-el történő emésztéssel és a 240 BP hosszúságú DNS-fragmens izolálásával. A két proinzulin-fragmens ligálásával 5 kapjuk a 320 Bp hosszúságú, helyes ligálási terméket (a 18 Bp hosszúságú adapterral együtt). Az így szerkesztett proinzulin-DNS-fragmenset az Eco RI-negativ hasítási helyen most már egy szabályozási tartománnyal 10 is ligálhatjuk.

A reakció teljes menetét a 2. ábrán tüntettük fel, ahol A, B és C jelentése: a proinzulin molekula egyes peptidláncai, Ad jelentése: az a) vagy b) jelű (defoszforilált) 15 adapter és Prae jelentése: a majom preproinzulin preszekvenciáját kódoló DNS.

Egy kémiai-szintetikus szabályozási tartományt - amely tartalmaz egy Bam Hl felismerési helyet, egy lac-operátort (O), egy 20 bakteriális promotort (P), egy ATG start-kodonnal rendelkező, 6-14 nukleotiddel megrövidített riboszómális kötési helyet (RB) és ehhez csatlakozó Eco Rí felismerési helyet (3. ábra szerint) - ligálunk az előzőekben leír- 25

tak szerint előállított proinzulin-fragmenshez a közös Eco Rí átfedési tartománynál.

Előnyös a kővetkező szintetikus szabályozási tartományt alkalmazzuk (a 2. táblázatból a lia jelű DNS-szekvencia, a P 34 30 683.8 sz. NSZK-beli szabadalmi bejelentésnek megfelelően):

5’ GATCCTAAATAAATTCTTGACATTTTTTAAA 3’

3’ GATTTATTTAAGAACTGTAAAAAATTT 5’

(Bam HI) P

5’ TAATTTGGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCG 3’

3’ ATTAAACCATATTACACACCTTAACACTCGC 5’

0

5’ GAATAACAATTTCACAGAGGATCTAG 3'

3’ CTTATTGTTAAAGTGTCTCCTAGATCTTAA 5’

RB (Eco Rí)

Ugyanígy alkalmazhatjuk a Táblázatban feltüntetett többi szintetikus szabályozási tartományt is. De az is lehetséges, hogy a szakirodalomban leírt természetes vagy levezetett (Perlman és társai előzőekben hivatkozott irodalmi közleménye) szignálszekvenciákat alkalmazzuk.

Táblázat

Szintetikus szabályozási tartomány (kódoló szál):

5’ GGATCCTAAATAAATTCTTGACATT1TTAA2TAATTTGGTATAATGT3T 4GAATTG5GAGCG6T7ACAATT8C9C10G11G12T13TA14TT15 (ATG) 3’

1=T

vagy G

7=A

vagy C

12=A

vagy

G

2=A

vagy C

8=T

vagy közvetlen kötés

13=C

vagy

T

3=G

vagy C

9=A

vagy TAGA

14=GAA vagy AGC

4=G

vagy A

10=A, TTTAAA, AAGCTT vagy

15=C

vagy

közvetlen kötés

5=T

vagy C

AAGCTA

6=C,

GA vagy GAA

11=AG vagy GA

Ilah jelű DNS-szekvencia:

1 2 5

6

7 8

10

11

12

13

14

15

3=G

Ila

TAT

GAA

A T

A

AG

A

C

GAA

c

4=G

b

TAT

GAA

A T

TTTAAA

AG

A

C

GAA

C

9=A

c

G C T

GAA

A T

TTTAAA

AG

A

C

GAA

C

d

G C T

GAA

A

AAGCTT

AG

A

C

GAA

C

e

G C C

GAA

A

AAGCTT

AG

A

c

GAA

c

f

G C T

C

C

AAGCTT

AG

A

c

GAA

c

g

G C T

GA

C

AAGCTT

AG

A

c

GAA

c

h

G C T

GA

C

AAGCTA

GA

G

T

AGC

—

A

Sma I/Bam Hl enzimekkel

történő két-A

HB 101

E. coli törzsben

történő szeszeres emésztés után a Bam Hl hasítási helyet Klenow-fragmenssel .fill—in " reakcióban betöltjük és a ligálás termékét (kb. 420 Bp 60 hosszú) gélelektroforézissel izoláljuk.

Az így előállított fragmenset „blunt-end" ligálással az 1. ábra szerinti pBR 322 részplazmidhoz ligáljuk (4. ábra). így kapjuk a pWI 6 hibridplazmidot. 65

lekció után a plazmid-DNS egyedi kiónjait a szabályozási tartományt tartalmazó 420 Bp hosszúságú fragmens és a Bal 31-el lerövidített proinzulingén integrációjára vizsgáljuk. A Bal 31-el történt helyes proinzulingén-rövidités (2. ábra) kimutatására a plazmidokat az integrált proinzulin fragmenssel az Eco Rí hasítási helytől kiindulva szekventáljuk. 60

7