197355. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szignálszekvencia előállítására proteinek transzportjára, expressziós rendszerekben
12 197355 13 szekventált klón közül 3 tartalmazta a két nukleotid kívánt rövidített változatát (4. ábra). 1 üg PWI 6 plazmidot Eco Rí restrikciós enzimmel hasltunk és ezt követően 30 ng I DNS-szekvencia jelenlétében 16 °G hőmérsékleten 6 órán keresztül ligáljuk. A HB 101 E. coli törzsben történő transzformáció után az egyedi kiónok közül a plazmidokat izoláljuk és restrikciós enzim-analízissel az I. DNS-szekvencia beépülését vizsgáljuk. Az összes kiónok 7%-a az I. DNS-szekvenciát integrált pWI 6 plazraid. Az integrációs reakció irányítottságát a restrikciós enzim-analizis szabványos módszereivel a Hind III/Pvu I-el történt kétszeres emésztés alapján egyértelműen meghatározhatjuk. A proinzulinhez viszonyítva helyes leolvasási irányítottsággal beépült I DNS-szekvenciát tartalmazó pWI 6 plazmidot pWIP 1 jelöléssel az 5. ábrán tüntettük fel. Ezt a plazmidot különböző E. coli törzsekbe transzformálva az egyes törzsek szintézis-kapacitását meghatározhatjuk. A preszekvencia-proinzulin fúzió E. coliban történő expresszióját a következők szerint határozzuk meg: 1 ml IPTG-vel (izopropil-ß-D-tiogalakto-piranozid) indukált baktérium kultúrát OD600=1,0 optikai sűrűségnél és 1 órás indukciós idő után 5.10-4 mól koncentrációnál PMSF-el (fenil-metil-szulfonil-fluorid) leállítunk, jégben lehűtjük és lecentrifugáljuk. A kicsapódott sejteket 1 ml puffer-oldattal (10 mmól tris-HCl, pH=7,6; 40 mmól NaCl) mossuk, centrifugáljuk és 200 m1 puffer-oldatban 5 (20 törnegX szacharóz, 20 mmól tris-HCl, pH=8,0; 2 mmól Edta) reszuszpendáljuk, 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, lecentrifugáljuk és rögtön 500 pl kétszer desztillált vízben reszuszpendáljuk. Jégen 10 10 percig inkubáljuk, majd a .sokk-lizálf baktériumokat lecentrifugáljuk, a felette lévő részt befagyasztjuk. Ennek a .maradéknak’ a proinzulin tartalmát standard-inzulin-RIA-ban (Amersham) meghatározzuk. 15 A kicsapódott baktériumokat még egyszer 200 pl lizozim-pufferban (20 tömegX szacharóz, 2 mg/ml lizozim, 20 nmól tris-HCl, pH=8,0, 2 mM EDTA) reszuszpendáljuk, 30 percig jégen inkubáljuk, 3-szor 10 percig 20 ultrahanggal kezeljük és centrifugáljuk. A sejtek feletti rósz, azaz a plazma-frakció proinzulin tartalmát radioimmunoassay készülékben meghatározzuk. A pWIP 1 plazmidot tartalmazó egyedi 25 baktériumklónok szintézis-kapacitását és a proinzulin-preszekvencia termék transzport képességét megvizsgáltuk. Az elvárásoknak megfelelelően az összes baktérium-klönnál a termelt proinzulin kb. 90%-a a periplazmati- 30 kus térbe transzportálódott. A proinzulin RIA-aktivitás kb. 10 tömeg%-a még a plazma-frakcióban volt található. 8
