197355. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szignálszekvencia előállítására proteinek transzportjára, expressziós rendszerekben
8 197355 9 sal (HPLC) vagy poli(akril-amid)-os gélelektroforézissel tisztítjuk. Teljesen azonos módon szintetizáljuk az Ib-If jelű génrészleteket is, amelyek nukleotid sorrendjét a II DNS-szekvencia képlete (a mellékletben található) megadja. 2. Az egy szálú oligonukleotidek enzimatikus összekapcsolása I DNS-szekvenciává Az la és If jelű, véghelyzetü oligonukleotidekét nem foszforiláljuk. Ezzel a kiálló végeken bekövetkező oligomerizációt kerüljük el. Az lb, Ic, Id és le oligonukleotideket a következők szerint foszforizáljuk. Az egyes oligomerekböl 1 nmol-t 5 nmol adenozin-trifoszfáttal és négy egység T4-polinukleotid-kinázzal 20 pl 50 mmol trisz-HCl-puffert (pH=7,6), 10 mmol magnézium-kloridot és 10 mmol ditio-treitolt (DTT) tartalmazó oldatban 30 percig 37 °C hőmérsékleten kezeljük. Az enzimet ezután 95 °C hőmérsékleten 5 percig tartó hőkezeléssel dezaktiváljuk. A kővetkező lépésben az la, lb, Ic, Id, le és If jelű oligonukleotideket egyesítjük és kettős szállá hibridizáljuk úgy, hogy 20 mmol-os KCl-oldatban felmelegitjük és lassan (kb. 2 órán keresztül) 16 °C hőmérsékletre lehűtjük. Az I DNS-szekvencia szerinti DNS-fragmenssé történő ligálás 100 egység T4-DNS-ligázzal, 40 ul 50 mmol trisz-HCl-puffert, 20 mmol magnézium-kloridot és 10 mmol DTT-t tartalmazó oldatban, 15 °C hőmérsékleten, 18 órás reakció során következik be. A génfragraenset gélelektroforézissel tisztítjuk 10%-os poli(akril-amid)-gélen (20x x40 cm, 1 mm vastag, karbamid adalék nélkül). A marker anyag ,0x174 DNS (a BRL cég gyártmánya) Hinf I-el hasítva, vagy pBR 322 Hae III-al hasítva. 3. A génfragmens beépítése pUC 8-ba A kereskedelemben kapható pUC 8 plazmidot az előállító adatai szerint, ismert módon az EcoR I restrikciós endonukleázzal felnyitjuk. Az emésztési terméket 5%-os poli(akril-amid)-gélen, ismert módon, elektroforézissel szétválasztjuk és a DNS-t etídium-bromiddal megszinezve vagy radioaktív jelzéssel ( .Nick-transzláció" Maniatis szerint, a már hivatkozott tankönyv alapján) láthatóvá teszszük. A plazmidsávot az akril-amid gélből kivágjuk és elektroforetikusan a poli(akril-amid)-ról leválasztjuk. 4. Az I DNS-szekvenécia beépítése egy expressziós plazmidba A pWI 6 expressziós plazmidot a majom-proinzulin számára szóló információs tarta- 6 lommal a következők szerint szerkesztjük meg: 10 zug pBR 322 plazmidot az Eco RI/Pvu II restrikciós endonukleázokkal megemészte- 5 tűk és ezt követően .fill—in ’-reakcióban Klenow-polimerézzal az Eco Rí hasitási helyet betöltjük. Az 5%-os poli(akril-amid)-gélen történő gélelektroforézises szétválasztás után a 2293 Bp hosszúságú plazmidfragmenset 10 elektroelúcióval kinyerjük (1. ábra). A Wetekam és társai: Gene 19 (1982) 179-183. oldal irodalmi közleményben leirt majom-pre. proinzulin-DNS-t tartalmazó pBR 322 plazmidból Hind III és Mst I restrikciós endonukle- 15 ázokkal megemésztetve izoláljuk a majompreproinzulin-DNS-t (1250 Bp hosszúságú fragmensként) és a pUC 9 plazmidba a következők szerint reklónozzuk: A pUC plazmidot Bam Hl enzimmel hasítjuk, a hasítás he- 20 lyett szabványos .fill—in ' reakcióban Klenow-polimerazzal (.large fragment") betöltjük, Hind III restrikciós enzimmel utánhasitjuk és a DNS-t az egyéb DNS-fragmenésektól 5%-os poli-(akril-amid)-gélen gélelektroforetikusan 25 elválasztjuk. A nyitott plazmidba az izolált, kb. 1250 Bp hosszúságú inzulin-DNS-fragmenst beépítjük. Az .untranslated region" és a preszekvencia leválasztásához a fentiek szerint mo- 30 difikéit pUC 9 plazmidot Hae III-mal megemésztetjük és a 143 Bp hosszúságú fragmenset a preszekvencia utolsó két nukleotidjének lehasitása érdekében Bal 31 enzimmel megemésztetjük. így az amino-végen első ko- 35 dónként a TTT áll, amely a B-lánc első aminosavjaként a fenil-alanint kódolja. Ehhez a fragmenshez .blunt end" tipusú ligaló reakcióval Eco Ri-re specifikus adaptort ligálunk: 40 a) 5’ AAT TAT GAA TTC GCA ATG Eco RI TA CCT AAG CGT TAC b) 5’ AAT TAT GAA TTC GCA AGA Eco Ri TA CTT AAG CGT TCT Annak érdekében, hogy az adapterok 45 polimerizációját elkerüljük, ezeket a ligáló reakcióban foszforilálatlanul alkalmazzuk (amelyet a mellékelt ábrákban Eco Ri" szimbólummal jelöltünk, ugyanúgy mint a betöltéssel inaktivált felismerési helyeket). Az a) 50 jelű adaptor végén metionint, a b) jelű adaptor végén arginint kódoló kodon van. Az a) változattal olyan génterméket kapunk, amelynél a bakteriális rész leválasztása bróm-ciános hasítással lehetséges, a b) 55 változat viszonL tripszines hasítást tesz lehetővé. A ligáit terméket Mbo II-vel emésztetjük meg. A gélelektroforézises szétválasztás után egy 79 Bp DNA-fragmenst kapunk, amely a 60 B-lánc 1-21 sorszámú aminosavainak információját tartalmazza. A proinzulin molekula maradék információjának génjét (beleértve a klónozásból eredő G-C-szekvenciét és a pBR 322-ből eredő 65 21 Bp hosszúságú részt a stop-kodonhoz
