197355. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szignálszekvencia előállítására proteinek transzportjára, expressziós rendszerekben
6 197355 7 például az előbbiekben említett, kereskedelemben kapható plazmidokba, már ismert módon történik. Egy eukariotikus gén E. coliban, a találmány szerinti preszekvencia segítségével történő expressziójára példaként a következőkben a majom-proinzulin szintézisét Írjuk le: Olyan DNS-szekvenciát szerkesztünk, amelynél a bakteriális promotorból, lac-operátorból és riboszómatikus kötési helyből álló kémiai-szintetikus szabályozási tartomány (P 3 430 683.8 sz. NSZK-beli szabadalmi bejelentés) mögött a riboszóma-kötési hely 6-14 nukleotidját eltávolítjuk, az EcoR I csatlakozó felismerési helyére az I DNS-szekvenciát és erre illesztve a proinzulin gént [W. Wetekam és társai: Gene 19 (1982) 179-183. p.] helyezzük el. Az exprimált proinzulin fúziós peptid az amino-végen még 9 kiegészítő aminosavat tartalmaz, amelyek enzimatikusan vagy kémiailag lehasithatók. A szintetikus gén pUC 8-ba történő beépítése, valamint az eukariotikus gént az I DNS-szekvenciához csatolva tartalmazó expressziós plazmidok konstrukciója már ismert módon történik. Itt Maniatis tankönyvére utalhatunk (Maniatis és társai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982). A kapott hibridplazmidok transzformációja alkalmas gazdaszervezetekbe, előnyösen E. coliba, hasonlóképpen ismert és az előzőekben említett tankönyv részletesen tárgyalja. Az exprimált proteinek kinyerése és tisztítása is ismert és leírt módon történik. A következő példákban a találmány néhány megvalósítási módját ismertetjük. A szakember számára önként adódik a példákból kiindulva nagyszámú egyéb lehetséges változat és kombináció. A százalékos adatok tömegszázalékban értendők, ha más nincs megadva. Példák 1. Egy szálú oligonukleotid kémiai szintézise A kódoló szál 1-29 sorszámú nukleotidjait tartalmazó, la jelű génrészlet példájával mutatjuk be a génrészletek szintézisét. Az M.J. Gait és társai: Nucleic Acids Res. 8 (1980) 1081-1096. o. irodalmi közleményben leirt ismert módszerekkel a 3’-végen álló nukleozid, jelen esetben a guanozin (19. sorszámú nukleotid) és a Merck cég által gyártott FRACTOSIL márkanevű kovasav gél között a 3’-hidroxil csoport segítségével kovalens kötést hozunk létre. Ehhez a kovasavgélt átalakítjuk 3-(trietoxiszilil)-propil-aminnal, amikor is etanol-képződés mellett Si-O-Si kötések jönnek létre. A guanozint N2’-izobutiril-3’-0-szukcinoil-5’-dimetoxi-tritil-éterként para-nitro-fenol és N,N’-diciklohexil-karbo-diimid jelenlétében a modifikált hordozóval reagáltatjuk, ekkor a szukcinoil-csoport szabad karboxil-csoportja a propil-amin-csoport amino-csoportjával reagál. A szintézis következő lépéseinél a bázikus komponenseket 5’-0-dimetoxi-tritil-nukleozid-3’-foszforossav-monometilészter-dialkil-amid vagy -klorid, és emellett az adenint N6-benzoil-vegyület, a citozint N^benzoil vegyület, a guanint N^izobutiril-vegyület formájában és az amino-csoportot nem tartalmazó timint védő csoport nélkül alkalmazzuk. A polimer hordozó 50 mg-ját, amely 2 (umol megkötött guanozint tartalmaz, egymás után a következő reagensekkel kezeljük: a) nitro-metán, b) telített 1 tömeg% vizet tartalmazó nitro-metános cink-bromid oldat, c) metanol, d) tetrahidrofurán, e) acetonitril, f) 40 pmol megfelelő nukleozid-foszfit és 200 /umol tetrazol 0,5 ml vízmentes acetonitrilben (5 percig), g) 20 tömeg% ecetsavanhidrid tetrahidrofuránban 40 tömeg% lutidinnel és 10 tömeg% dimetil-amino-piridinnel (2 percig), h) tetrahidrofurán, i) 20 tömeg% vizet és 40 tömeg% lutidint tartalmazó tetrahidrofurán, j) 3 tömeg% jód 5:4:1 térfogatarányú kollidin/viz/tetrahidrofurán elegyben, k) tetrahidrofurán, l) metanol. A .foszfit" vegyület a fenti felsorolásban dezoxiribóz-3’-monofoszforossav-monometil-észter, és a foszforatom harmadik vegyértékét klóratom vagy tercier amino-csoport, például morfolinocsoport köti le. Az egyes szintézis-lépések kitermelését a mindenkori detritiláló reakció (b) után a dimetoxi-tritil kation 496 nm hullámhosszon mért abszorpciójával tudjuk spektrofotometriásán meghatározni. Az oligonukleotid szintézisének befejezése után az oligomer metil-foszfát védőcsoportjait p-tiokrezollal és trietanol-aminnal lehasitjuk. Ezt követően 3 órás ammóniás kezeléssel az oligonukleotidet eltávolítjuk a szilárd hordozóról. Az oligomer koncentrált ammóniával történő 2-3 napos kezelése sotán a bázisok amino-védő csoportjai kvantitatíve lehasadnak. Az így előállított nyers terméket nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárás-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 5
