197355. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szignálszekvencia előállítására proteinek transzportjára, expressziós rendszerekben
4 197355 5 Előnyös gazdaszervezetek az E. coli; Streptomyces; Staphylococcus fajták, például az S. aureus; Bacillus fajták, például a B. subtilis, B. amyloliquifaciens, B. cerus vagy B. licheniformis; Pseudomonas; Saccharomyces; Spodoptera frugiperda és a fejlettebb szervezetek sejtvonalai, például a növényi és állati sejtek. Elvileg minden olyan prokariotikus és eukariotikus eredetű protein, amely a membránon át képes jutni, transzport-expresszióval kinyerhető. Lényegesek viszont a gyógyszerészetileg jelentős peptidtermékek, például a hormonok, limfokinek, interferonok, véralvadást elősegítő szerek és vakcinák, amelyek a természetben is aminoterminális preszekvenciájú peptidekként vannak kódolva. Ezeket az eukariotikus preszekvenciákat viszont a prokariotikus gazdaszervezetek saját szignálpeptidázai nem hasítják le. 5 Az E. coliban a transzport-expresszióhoz alkalmasak a periplazmatikus és .outer membrane'-proteinek génjei, amikor is az elsők a terméket a periplazmába, az utóbbiak viszont a külső membránra irányítják. 10 Példaként bemutatjuk az E. coliban jól exprimálható lúgos foszfatáz periplazmatikus protein DNS-szignál-szekvenciáját, anélkül, hogy a találmányt erre korlátoznánk. Az E. coli lúgos foszfatázának első húsz 15 aminoBavát is magában foglaló preszekvencia a következő: 1 5 10 Met-Lys-Gln-Ser-Thr-Ile-Ala-Leu-Ala-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu- 15 20 25 Phe-Thr-Pro-Val-Thr-Lys-Ala-Arg-Thr-Pro-Glu-Met-Pro-Val- 30 3^ 40 Leu-Glu-Asn-Arg-Ala-Ala-Gln-Gly-Asn-Ile-Thr-Ala-Pro Jelentése: a szignálpeptidáz kitüntetett hasítási helye Azt találtuk, hogy ha a preszekvencia az érett protein első aminosavai közül max. 40-et, de legtöbbször kb. 20-at tartalmaz, akkor az a korrekt folyamathoz elegendő. Sok esetben viszont kevesebb kiegészítő 05 aminosav is elegendő, például kb. 10 vagy előnyösebben kb. 5. Mivel a rövidebb proteinlánc kevésbé veszi igénybe a gazdasejt protein-bioszintetizáló szerkezetét, ezéi’t a találmány egyik előnyös kivitelezési formája 40 az I DNS-szekvencia (képlete a mellékletben), amely a lúgos foszfatáz preszekvenciáját és az érett protein további 5 aminosavát kódolja. Az I DNS-szekvencia megfelel a lúgos foszfatáz természetes szekvenciája néhány 45 triplett-variációjának - mégpedig olyan variációknak, amelyek szinguláris restrikciós enzim hasítási helyeket vezetnek be és a GTG startkodont ATG-vel helyettesítik. A kódoló szál végén az EcoR I restrikciós endo- SO nukleáznak megfelelő, .kiálló” DNS-szekvencia van, amely lehetővé teszi a szokásos klónozó vektorokba, például a kereskedelemben kapható pBR 322, pUC 8 vagy pUC 12 plazmidokba történő beépítést. Az I. DNS-szek- 05 vencia génjének belsejében további szinguláris restrikciós enzim hasitási helyek vannak, amelyek lehetővé teszik egyrészt heterológ gének csatolását a megfelelő helyekre és a kívánt leolvasó vázszerkezet szerint, más- 60 részt a variációk megvalósítását, ezek a hasítási helyek a következők: Restrikciós A kódoló szál nukleotid enzim sorszáma, amely után a hasítási hely következik Sau 3 A 19 Pvu I 22 Hpa II 54) (A természetes génben Nci I 54) is előfordul) Alu I 66 Hph I 68 Ava II 70 Magától értetődően lehetséges az is, hogy a .kiálló' szekvenciát úgy konstruáljuk, hogy különböző restrikciós enzimeknek is megfeleljen, és ezzel az alkalmas vektorokba meghatározott orientációval történő beépítés lehetővé váljon. A szakembernek ebben az esetben mérlegelnie kell, mi a munkaigényesebb, a gén megszerkesztése és meghatározott módon történő beépítése, vagy a járulékos szétválasztás, amelyet a .kiálló' végek azonossága esetén a kétféle orientációs irányban történő beépülés eredményez. Az I DNS-szekvencia egyenként 26-31 bázist tartalmazó hat oligonukleotidből felépíthető. Az egyes oligonukleotideket kémiailag szintetizáljuk és a hat nukleotid .sticky end '-jeit enzimatikusan csatoljuk. A szintetikus gén beépítése a klónozó vektorokba, 4
