197354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó streptomyces kiválasztására.
12 197354 13 musok növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges, esszenciális nyomelemeket is kell adnunk a tápközeghez. Az ilyen nyomelemeket általában tisztátalanság formájában a tápközeg más alkotórészeinek kiséröjeként szolgáltatjuk. . A Streptomyces aerob tenyésztési körülmények között nő viszonylag széles, 5 és 9 közti pH tartományban és 15 °C és 40 °C közti hőmérséklettartományban. A plazmid fenntartásához és stabilitáshoz kívánatos a tenyésztő tápközeggel kb. pH 7,2-nél kezdeni és a tenyészet hőmérsékletét mintegy 30 °C hőmérsékleten fenntartani. Az itt következő példák tovább illusztrálják és részletezik az itt ismertetett találmányt. A találmány létrehozásához szükséges aktuális eljárásokat leírjuk és magyarázatot adunk, ahol ez szükségesnek látszik.Az alábbiakban röviden ismertetjük, hogy az egyes ábrák mit mutatnak be. Az 1. ábra a pSVB2 plazmid restrikciós hely- és működési térképét mutatja be. A 2. ábra a pIJ702 plazmid restrikciós hely- és működési térképét mutatja be. A 3. ábra a pSVB12 plazmid restrikciós hely- és működési térképét mutatja be. A 4. ábra a pSVB23 plazmid restrikciós hely- és működési térképét mutatja be. Az 5. ábra a pSVB16 plazmid restrikciós hely- és működési térképét mutatja be. A 6. ábra a pSVB18 plazmid restrikciós hely- és működési térképét mutatja be. A 7. ábra a pSVB20 plazmid restrikciós hely- és működési térképét mutatja be. A 8. ábra a pSVB22 plazmid restrikciós hely- és működési térképét mutatja be. A 9. ábra a pSVB3310 fág restrikciós hely- és működési térképét mutatja be. A 10. ábra a pSVB3311 fág restrikciós hely- és működési térképét mutatja be. 1. példa A pS VB plazmid izolálása A.) A Streptomyces lividans TK23/pSVB2 tenyésztése Mintegy 10® Streptomyces lividans TK23/pSVB2 (NRRL 15 880) spórát inokulálunk 10 ml TSB tápközegbe (Trypticase Soy Broth; a TSB-t 30 g/1 koncentrációban készítjük; ez az anyag rendelkezésre áll a következő forrásból: Bethesda Research Laboratories, Inc., 8717 Grovemont Circle, P.O. Box 577, Gaithersburg, Maryland 20 760, Amerikai Egyesült Államok), amely 10 pg/ml tiosztreptont is tartalmaz, és 29 °C hőmérsékleten növesztjük, amig a tenyészet eléri a korai stacionárius fázist. A tenyészetet ezután homogenizáljuk, és 5 ml homogenizált tenyészetet használunk fel 100 ml TSB inokulálásra, amely szintén tartalmaz tiosztreptont. A 100 ml-es tenyészetet 29 °C hőmérsékleten inkubáljuk, amig a Streptomyces lividans TK23/pSVB2 sejtek elérik a stacionárius fázist. B. A plazmid izolálása A sejteket összegyűjtjük és egyszer mossuk 10,3%-os szacharóz oldattal. A sejteket ezután szuszpendáljuk 24 ml 10,3%-os szacharóz oldatban, és 6 ml 5-szörös lizozim-oldatot (125 mmól/liter Trisz-HCl, pH 8; 125 mmól/liter NaíEDTA, pH 8; 10 mg/ml lizozim; és 10,3% szacharóz) adunk hozzá. Keverés majd 30 °C hőmérsékleten 30-60 percen át végzett inkubálás után 18 ml, 0,3 mól/liter NaOH-t és 1% SDS-t (nátrium-dodecil-szulfát) tartalmazó, 50 °C hőmérsékletre előmelegített oldatot adunk hozzá, összekeverjük, és az igy létrejött keveréket 80 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10 percen át. A keveréket ezután lehűtjük szobahőmérsékletre, és 12 ml oldatot, amelyet 500 g fenol, 500 g CHCb és 0,5 g 8-hidroxi-kinolin 200 ml vízzel való összekeverésével állítottunk elő, adunk hozzá, és jól összekeverjük a sejt-kivonattal. A fázisokat 6000-8000 fordula/percnél 10 percen át végzett centrifugálással elkülönítjük; az igy létrejött felülúszó mintegy 45 ml-ét átvisszük egy tiszta palackba. Ezt követően 4,5 ml 3 mól/literes nátrium-acetát oldatot és 50 ml izopropanolt adunk a felülúszóhoz, és az oldatot összekeverjük, majd 30 percen ét szobahőmérsékleten hagyjuk. Az oldatot azután centrifugáljuk (8000 fordulat/perc, 30 perc), és a keletkezett felülúszót eldobjuk. A szemcséket újra szuszpendáljuk 7,5 ml TE pufferban (10 mmól/liter Tris-HCl, pH 8 és 1 mmól/liter EDTA), amely 8 g CsCl-t is tartalmaz. 0,5 ml 10 mg/ml-es etídiura-bromid oldat hozzáadása után az oldatot 40 000 fordulat/percnél centrifugáljuk 48 órán át 20 °C hőmérsékleten. Az igy létrejött plazmid-sávokat 3-5-ször extraháljuk TE-pufferral és CsCl-el telített izopropanollal. Az extrakciók után a mintát négy térfogat TE pufferral hígítjuk, majd a végső térfogatra számítva 2,5 térfogat etanolt adunk hozzá. Az így létrejött oldatot összekeverjük és egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten történt inkubálásból nyert csapadékot centrifugálással (10000 fordulat/perc, 30 perc) összegyűjtjük, megszárítjuk és kétszer újra kicsapjuk. A csapadékot úgy készítjük, hogy a szemcséket TE pufferban szuszpendáljuk, hozzáadunk NaOAc-t 0,3 mól/liter koncentrációig, hozzáadunk 2,5 térfogat etanolt, hűtjük -70 °C hőmérsékleten 10-15 percig, majd centrifugáljuk az oldatot a fentiek szerint. Az eljárással kb. 100 pg pSVB2 plazmid DNS-t lehet termelni, amelyet TE pufferban szuszpendálunk 1 ug/ul koncentrációban, és 4 °C hőmérsékleten tárolunk. 5 IC 15 20 25 30 35 40 45 5C 55 60 65 8
