197354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó streptomyces kiválasztására.
14 197354 15 2. példa A pIJ702 plazmid izolálása Streptomyces lividans/pIJ702-t (ATCC 39 155) tenyésztünk és a pIJ702 plazmidot izoláljuk lényegében az 1. példában megadott kitanitéssal összhangban. Tiosztrepton szelekciót (10 ug/«nl) alkalmazunk, hogy biztosítsuk a pIJ702 plazmid fenntartását. A nyert mintegy 100 ug pIJ702 plazmid DNS-t 1 ml TE-ben szuszpendáljuk és 4 °C hőmérsékleten tároljuk. 3. példa A pSVB12 és pSVB23 plazmidok megalkotása A.) A pSVB2 plazmid Kpn I emésztése és a mintegy 2,6 kb-s Kpn I restrikciós fragmens tisztítása Mintegy 50 ug (50 ul), az 1. példa szerint izolált pSVB2 plazmid DNS-t összekeverünk 10 pl 10-szeres Kpn I pufferral*, 5 /ni (50 egység) Kpn I restrikciós enzimmel és 35 ul H20-val és reagáltatjuk 37 °C hőmérsékleten két órán át. Hő-inaktiválás után a reakciókeveréket agaróz gélbe visszük és a kívánt mintegy 2,6 kb-s Kpn I restrikciós fragmenst megtisztítjuk lényegében Maniatis és munkatársai kitanitásával összhangban [Molecular Cloning, 164-166 oldal, (1982)]. A nyert mintegy 10 ug-nyi, a tilozin rezisztencia génjét tartalmazó -2,6 kb-s Kpn I restrikciós fragmenst 100 ul TE pufferban szuszpendáljuk, és 4 °C hőmérsékleten tároljuk. * A 10-szeres Kpn I puffer összetétele a következő: 60 mmól/liter NaCl; 60 mmól/liter Trisz-HCl, pH 7,5; 60 mmól/liter MgCk; 60 mmól/liter 2-merkapto-etanol 1 mg/ml BSA (szarvasmarha szérum albumin) B.) A Kpn I-el emésztett pIJ702 plazmid előállítása Mintegy 1 ug (10 ul), 2. példa szerint izolált pIJ702 plazmid DNS-t összekeverünk 5 ul 10-szeres Kpn I pufferral, 2 ul (10 egység) Kpn I restrikciós enzimmel és 33 ul H20-val, és 37 °C hőmérsékleten reagáltatjuk két órán át. 65 °C hőmérsékleten 10 percen ét végzett hő-inaktiválás után az emésztett plazmid-DNS-t -20 °C hőmérsékleten tároljuk. C. A fragmensek ligálása a pSVB12 és pSVB23 plazmidok képzésére 5 ul, a 3 A. példa szerint készített, mintegy 2,6 kb-s Kpn I restrikciós fragmenst összekeverünk 25 ul, a 3 B. példa szerint előállított, Kpn I-el emésztett pIJ702 plazmiddal, majd csapadékot képzünk 3 ul 3 mól/literes NaOAc oldat és 75 ul etanol hozzáadásával, -70 °C hőmérsékleten hűtjük 30 percen ét, majd centrifugáljuk. Az Így képződött DNS szemcséket 39 ul 1-szeres ligáz pufferban* szuszpendáljuk, majd egy éjszakán át inkubáljuk 16 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS-ek alkotják a kívánt pSVB12 és pSVB23 plazmidokat. A plazmidok csupán a mintegy 2,6 kb-s Kpn I restrikciós fragmens orientációja szempontjából különböznek (lásd 3. és 4. ábrák). * Az 1-szeres ligáz puffer összetétele a következő: 50 mmól/liter Trisz-HCl, pH 7,8 10 mmól/liter MgCk 20 mmól/liter ditiotreitol 1 mmól/liter ATP 50 ug/ml BSA 4. példa A pSVBlß és pSVB18 plazmidok megalkotása A.) A pSVB2 plazmid emésztése Pst I-el, és a mintegy 3,8 kb-s Pst I restrikciós fragmens tisztítása Mintegy 50 ug (50 ul), az 1. példa szerint izolált pSVB2 plazmid DNS-t összekeverünk 10 ul 10-szeres Pst I pufferral*, 5 ul Pst I restrikciós enzimmel és 35 ul HzO-val, majd reagáltatunk 37 °C hőmérsékleten két órán át. A kívánt, mintegy 3,8 kb-s tilozin-rezisztencia gént tartalmazó Pst I fragmenst lényegében a Maniatis és munkatársai által megadott (1982) kitanitással összhangban tisztítjuk, és a nyert mintegy 10 ug tisztított fragmenst 100 ul TE pufferban szuszpendáljuk és 4 °C hőmérsékleten tároljuk. A 10-szeres Pst I puffer összetétele a következő: 1 mól/liter NaCl 100 mmól/liter Trisz-HCl, pH 7,5 100 mmól/liter MgCk 1 mg/ml BSA 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
