197354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó streptomyces kiválasztására.
10 197354 11 S. grjseofuBCUs, S. fradiae, S. ambofaciens és S. toyocaensis. A jelen találmány szerinti módszer és a rekombináns klónozó vektorok széleskörű alkalmazást nyerhetnek és segítenek kielégíteni az igényt a megfelelő klónozó közvetítőkre Streptomyce8ben és rokon organizmusokban való alkalmazáshoz. Ezen kívül a jelen vektoroknak az a képessége, hogy tilozin-rezisztenciát visznek ét, funkcionális eszközt nyűjt transzformánsok kiválasztására. Ez fontos annak gyakorlati szükségessége miatt, hogy meg tudjuk határozni és ki tudjuk választani azokat a sejteket, amelyek befogad. ták a vektor DNS-t. További DNS szegmenseket, amelyek nem rendelkeznek jelenlétüket kimutató funkcionális vizsgálati módszerrel, szintén be lehet iktatni a jelen vektorokba, majd a transzformánsokat, amelyek tartalmazzák a nem kiválasztható DNS szegmenseket, tilozin-kiválasztással lehet izolálni. Ilyen nem kiválasztható DNS szegmenseket bármilyen helyre be lehet iktatni, kivéve azokba a területekbe, amelyek szükségesek a plazmid működéséhez és replikációjához, vagy a tilozin-rezisztencia átvivő génbe, lehet viszont azokba a génekbe (a teljesség igénye nélkül felsorolva), amelyek az antibiotikum-módosító enzimeket szabályozzék, valamint az összes típusú szabályozó génbe. Részletesebben, egy nem kiválasztható DNS szegmenst, amely egy gént magában foglal, egy plazmidba, pl. a SVB2 plazmidba iktatunk a tiosztrepton rezisztencia gén központi Cia I restrikciós helyénél. Egy ilyen beiktatás inaktiválja a tiosztrepton rezisztencia gént és így lehetővé teszi a rekombináns plazmidot tartalmazó transzformánsok könnyű azonosítását. Ezt úgy végezzük el, hogy először kiválasztunk a tilozin rezisztencia Bzerint, majd másodszorra azonosítjuk azokat a tilozin-rezisztens transzformánsokat, amelyek nem rezisztensek tiosztreptonra. Ennél fogva az a képesség, hogy tilozin-rezisztenciára szelektálhatunk Streptomycesben és rokon sejtekben, lehetővé teszi azoknak az egészen ritka sejteknek a hatásos kiválasztását is, amelyek tartalmazzák a szóban forgó nem kiválasztható DNS-t. A tilozin rezisztenciára történő funkcionális vizsgálat, amint ezt fentebb leírtuk, alkalmas azoknak a DNS szegmenseknek az elhelyezésére is, amelyek egy egyedi antibiotikum-rezisztencia-étvivő gén szabályozó elemeiként és közvetlen kifejezőjeként működnek. Ilyen szegmenseket, amelyek lehetnek pl. (a teljesség igénye nélkül) promotorok, attenuátorok, represszorok és induktor kötőhelyek, riboszomális kötőhelyek, stb., alkalmazunk a Streptomyces és rokon organizmusok sejtjeiben levő más gének kifejeződésének szabályozására. A jelen találmány szerinti tilozin-rezisztenciára átvivő vektorok használhatók annak biztosítására is, hogy a kapcsolt DNS szegmensek stabilan fennmaradjanak a gazdasejtben több generáción keresztül. Ezeket a géneket vagy DNS fragmenseket, amelyek kovalensen vannak kapcsolva a tílozin-rezisztencia-átvivő restrikciós fragmenshez és Streptomycesben vannak szaporítva, úgy tartjuk fenn, hogy a transzformánsokat olyan tilozin-szintnek tesszük ki, amely toxikus a nem transzformált sejtekre. Ennél fogva azok a transzformánsok, amelyek elvesztették a vektort és következésképpen mindenféle kovalensen kötött DNS-t, nem tudnak növekedni és kiküszöbölődnek a tenyészetből. így a jelen találmány szerinti vektorok stabilizálni ób fenntartani képesek bármilyen szóban forgó DNS -t. A jelen találmány szerinti módszer, klónozó vektorok és transzformánsok a gének olyan klónozásét segítik elő, amely javítja a Streptomycesekben és rokon sejtekben jelenleg előállított különböző termékek kitermelését. Ilyen termékek (de nem korlátozó jelleggel) pl, streptomicin, cefalosporinok, aktaplanin, apramicin, naraszin, monenzin, tobramicin, eritromicin, stb. A jelen találmány olyan kiválasztható vektorokat is nyújt, amelyek használhatók különböző anyagokat kódoló DNS szekvenciák klónozására, jellemzésére és helyreállítására; ilyen anyagok pl. a kereskedelmileg fontos fehérjék, mint a mumán inzulin, humán proinzulin, glukagon, interferon, stb. A jelen találmány szerinti kiválasztható vektorok alkalmazhatók kereskedelmileg fontos folyamatokhoz és vegyületekhez vezető metabolikus utakban levő enzimeB funkciókhoz, vagy olyan szabályozó elemekhez, amelyek javítják a gén kifejeződését. Ezek a kívánatos DNS szekvenciák lehetnek (nem korlátozó jelleggel említve) olyan DNS-ek, amelyek antibiotikum-származékok szintézisét katalizáló enzimeket kódolnak (ilyen antibiotikum-származékok lehetnek pl. Btreptomicin-, cefalosporin-, apramicin-, aktaplanin-, naraszin-, tobramicin-, monenzin- és eritromiein-származékok), vagy olyan enzimeket, amelyek antibiotikumok és más termékek bioprodukcióját összekapcsolják és növelik. Az a képesség, hogy ilyen DNS szegmenseket iktathatunk be és stabilizálhatunk Így, lehetővé teszi a Streptomyces és rokon organizmusok által termelt antibiotikumok kitermelésének és hozzáférhetőségének növelését. A Streptomycest sokféle módon lehet tenyészteni, sokféle különböző tápközeg bármelyikét alkalmazva. A tenyésztő tápközegben előnyös szénhidrát-források lehetnek pl. a melasz, glükóz, dextrin és glicerin. Nitrogén-források lehetnek pl. a szójaliszt, aminosav-keverékek és peptonok. Tápanyagként szervetlen sókat szintén beépítünk, ilyenek lehetnek mindazok a kereskedelemben kapható sók, amelyek képesek nátrium, kálium, ammónium, kalcium, foszfát, klorid, szulfát, stb. ionokat termelni. Amint ez más mikroorganiz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
