197354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó streptomyces kiválasztására.
4 197354 5 fragmense tartalmazza a jelen találmány szerinti teljes tílozin-rezisztencia átvivő gént. A tilozin-rezisztencia-átvivő gén helyének ismerete lehetővé teszi más klónozó vektorok megalkotását isi amelyek szintén alkalmazhatók a jelen módszerben. így a pSVB12 és pSVB23 plazmidokat úgy alkottuk meg, hogy a mintegy 2,6 kb-s tilozin-rezisztencia-átvivő Kpn I restrikciós fragmenst beiktattuk a pIJ702 plazmid Kpn I helyébe. A két Így létrejött plazmid, a pSVB12 és pSVB23 csupán a beiktatott fragmens orientációjára vonatkozóan különbözik. A pIJ702 kiindulási anyagot jelentő plazmidot a Streptomyces lividans/ /pIJ702-ből nyerhetjük, amely törzs letétbe van helyezve és részét képezi az American Type Culture Collection állandó törzstenyészet-gyűjteménynek ATCC 39 155 letéti számon (American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852, Amerikai Egyesült Államok). A pIJ702, pSVB12 és pSVB23 plazmidok restrikciós hely- és funkciós térképeit a mellékelt ábrák közül a 2., illetve 3., illetve 4. ábra mutatja be. A pSVB16 és pSVB18 plazmidokat olyan módon alkottuk meg, hogy a pSVB2 plazmid mintegy 3,8 kb-s Pst I restrikciós fragmensét beiktattuk a pIJ702 plazmid Pst I helyébe. Ismét két plazmid jött létre a beiktatott fragmens két lehetséges orientációja miatt, A pSVB16 és pSVB18 plazmidok szintén alkalmazhatók a jelen módszerben, mivel a beiktatott fragmens tartalmazza a pSVB2 plazmid mintegy 2,6 kb-s Kpn I tilozin-rezisztencia-átvivő restrikciós fragmensét. A pSVB16 és pSVB18 plazmidok restrikciós hely- és funkciós térképeit a mellékelt ábrák közül az 5.) illetve 6.) ábra mutatja be. További bemutatásra szolgáló plazmidokat alkottunk meg a pSVB2 plazmid mintegy 2,9 kb-s Banül-BgRI restrikciós fragmensének beiktatásával a pIJ702 plazmid Bgl II helyébe, ilyen módon inaktiválva a pIJ702 plazmid ban jelen levő tirozináz gént. Bár az Így létrejött plazmidok, amelyeket pSVB20- -nak és pSVB22-nek jelölünk, különböznek egymástól a beiktatott fragmens orientációját illetően, mindkettő átviszi a tilozin-rezisztenciát a tilozin-érzékeny Streptomyces-gazdasejtekbe. A pSVB20 és pSVB22 plazmidok restrikciós hely- és funkciós térképeit a mellékelt ábrák közül a 7.) illetve 8.) ábra mutatja be. A jelen találmány bemutatására szolgáló vektorok megalkotásához alkalmazott restrikciós fragmenseket hagyományos módon lehet módosítani a ligálás megkönnyítése érdekében. így pl. molekuláris kapcsolókat lehet szolgáltatni egy bizonyos, tilozin-rezisztencia gént tartalmazó restrikciós fragmenshez vagy a replikálódási vagy integrálódási funkciót tartalmazó DNS-hez, így az ezt követő ligáláshoz fajlagos helyeket lehet kényelmesen megalkotni. Ezenkívül a különböző, tilozin-rezisztencia gént tartalmazó restrikciós fragmenseket, a replikációs vagy integrációs szekvenciák kiindulási helyeit módosítani lehet bizonyos nukleotidok hozzáadásával, eltüntetésével vagy helyettesítésével, ilyen módon a restrikciós helyek választékát lehet nyújtani a DNS ligálásához. Azok, akik a szakterületen jártasak, ismerik a nukleotid- kémiát és a genetikai kódot és Így tudják, hogy mely nukleotidok helyettesíthetők egymással és mely DNS módosítások kívánatosak speciális célokra. Szintén megjegyzésre méltó, hogy a mintegy 2,6 kb-s Kpn I tilozin-rezisztencia gént tartalmazó restrikciós fragmens nem korlátozódik egy adott helyzetre egy klónozó vektoron, amíg a kritikus, vektorral szabályozott funkciók nincsenek megszakítva. Azok, akik a szakterületen jártasak, megértik vagy könnyen meg tudják határozni, hogy a vektoron mely helyek előnyösek egy bizonyos, tilozin-rezisztencia gént tartalmazó restrikciós hely ligációjához vagy beiktatásához. Bár a fentebb leírt vektorok tartalmazzák a pIJ702 plazmidból származó Streptomyces replikont, különböző ismert Streptomyces replikonok alkalmazhatók hasonló vektorok megalkotásához. Az 1. Táblázat, amely illusztráció célját szolgálja és nem teljesen átfogó jellegű, felsorol Streptomyces plazmidokat, amelyekből további funkcionális Streptomyces replikonok nyerhetők. Azok, akik a szakterületen jártasak, elfogadják, hogy a plazmid egészét vagy egy részét fel lehet használni olyan vektorok megalkotásához, amelyek példaként szolgálnak a jelen találmányhoz, mindaddig, amig a replikon-funkció nincs megszakítva. A plazmidot tartalmazó gazdaszervezeteket és a törzsgyűjteményi letéti számokat szintén megadjuk az 1. Táblázatban. 1. Táblázat Streptomyces plazmidok Plazmid Gazdaszervezet Letéti szám SCP2 Streptomyces coelicolor A3 (2) NRRL* 15 042 SCP2* Streptomyces coelicolor Ml 10 NRRL 15 041 pEL7 Streptomyces ambofacien8/pEL7 NRRL 12 523 pUC6 Streptomyces espinosus NRRL 11 439 -pTJC3 Streptomyces 3022A NRRL 11 441 SLP1 Streptomyces lividans NCIB*' 11 417 pNMIOO Streptomyces Virginiáé NRRL 15 156 pEL103 Streptomyces granuloruber A 39 912. 13/pEL103 NRRL 12 549 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 50 55 4
