197354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó streptomyces kiválasztására.
6 197354 7 * Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, Amerikai Egyesült Államok ** National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Post Office Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB98D6, Skócia, Egyesült Királyság A JÍC31 fág jól ismert Streptomyces-fág, amely kiváló kiindulási anyag forrás integrativ tilozin-rezisztencia-étvivő vektorok megalkotásához, amelyek további példaként szolgálnak a jelen találmányhoz. A DC31 fág származéka, a pKC331 fazmid, különösen előnyős ilyen integrálódó vektorok megalkotásához; ezt az E. coli K12. BE447/pKC331-ből lehet nyerni; ez a törzs letétbe van helyezve és részét képezi a fentebb említett Northern Regional Research Laboratory állandó törzstenyészet-gyüjteménynek NRRL B-15 828 letéti számon. A pKC331 fazmid mintegy 37 kb-s Pst I restrikciós fragmensének ligálása a pSVB2 plazmid mintegy 3,8 kb-s tilozin-rezisztencia-átvivó Pst I restrikciós fragmenséhez a pSVB3310 és pSVB3311 fág-származékokat eredményezi. Ezek a fágok integrativ vektorok, amelyek átviszik a tilozin-rezisztenciát Streptomycesbe és igy további példáit szolgálják a jelen találmányoknak. A pSVB3310 és pSVB3311 fágok restrikciós hely- és funkciós térképeit a mellékelt ábrák közül a 9.) illetve 10.) ábra mutatja be. A jelen találmány szerinti vektorok tartalmaznak egy Streptomyces replikont és egy tilozin-rezisztencia átvivő restrikciós fragmenst. Mivel a plazmidok sokszorozódását és manipulálását gyorsabban és hatékonyabban lehet végezni E. coliban, mint Streptomycesben, kényelmes hozzáadni olyan DNS szekvenciákat, amelyek lehetővé teszik a replikációt E. coliban. így funkcionális replikont tartalmazó és antibiotikum-rezisztencia-átvivő restrikciós fragmensek, amelyek E. coli plazmidokból, pl. pBR322-ből, pACYC184-böl, pBR325-ből, pBR328-ból, stb. származnak, hozzáadása nagyon előnyös és növeli a jelen, bemutatásra szolgáló vektorok általános hasznosságát. A jelen módszerben alkalmazott vektorok tilozin-rezisztenciát visznek át tilozin-érzékeny Streptomycesbe vagy rokon gazdasejtekbe. Míg 10 wg/ml tilozin általában toxikus a tilozinérzékeny Streptomycesre, a jelen találmány szerinti vektorok olyan szintű rezisztenciát visznek át, amely eléri a 10 mg//ml tilozint. A kiválasztás céljára előnyös tilozin-koncentráció azonban kb, 50 /ug/ml Streptomyces griseofuscusnál és 500 jug/ml S. lividansnál. Az előnyös tilozin-koncentráció a kiválasztás céljára más Streptomyces fajoknál könnyen meghatározó a szakterületen ismert módszerekkel. Bár a jelen találmány bármelyik megtestesülési formája használható, néhány rekombináns DNS klónozó vektor és transzformáns előnyős közülük. Ennek megfelelően az előnyös vektorokat és transzformánBokat a 2. Táblázatban soroljuk fel. 2. Táblázat Előnyős vektorok és transzformánsok Vektor Transzformáns pSVB2 Streptomyces lividans pSVB2 Streptomyces griseofuscus pSVB12 Streptomyces lividans pSVB12 Streptomyces griseofuscus pSVB23 Streptomyces lividans pSVB23 Streptomyces griseofuscus pSVB16 Streptomyces lividans pSVB16 Streptomyces griseofuscus pSVB18 Streptomyces lividans pSVB18 Streptomyces griseofuscus pSVB20 Streptomyces lividans pSVB20 Streptomyces griseofuscus pSVB22 Streptomyces lividans pSVB22 Streptomyces griseofuscus A jelen találmány szerinti módszer és a rekombináns klónozó vektorok nem korlátozódnak a Streptomyces egy egyedi fajtájában vagy törzsében való használatra. Éppen ellenkezőleg, a módszer és a vektorok széles körben alkalmazhatók és lehet használni sok Streptomyces-osztály gazdasejtjeihez, különösen gazdaságilag fontos osztályok restrikció nélküli törzseihez, amely osztályok az olyan antibiotikumokat állítják elő, mint az aminoglükozidok, makrolidok, B-laktámok, poliéterek és glikopeptid-antibiotikumok. Ilyen restrikció nélküli törzsek könnyen kiválaszthatok és izolálhatok a Streptomyces osztályokból hagyományos, a szakterületen jól ismert módszerekkel [Lomovskaya és munkatársai: Microbiological Reviews, 44, 206 (1980)]. A restrikció nélküli gazdasejtekben hiányoznak a restrikciós enzimek, ennél fogva nem hasítják el vagy nem roncsolják szét a plazmid DNS-t a transzformáció során. A jelen alkalmazás céljaira azokat a gazdasejteket, amelyek, bár tartalmaznak restrikciós enzimeket, nem hasítják el a jelen vektorok egy k restrikciós helyét sem, szintén restrikció nélkülinek tekintjük. Előnyös gazdasejtek a tilozin-érzékeny Streptomyces fajok restrikció nélküli törzsei közül azok, amelyek aminoglükozid antibiotikumokat termelnek, és amelyekben a jelen módszer különösen hasznos és amelyekbe a jelen vektorok transzformálhatók; ilyen restrikció nélküli törzsek pl.: S. kanamyceticus (kanamicinek), S. chrestomyceticus (aminozidin), S. griseoflavus (MA 1267 antibiotikum), S. microsporeus (SF-767 antibiotikum), S. ribosidificus (SF-733 antibiotikum), S. flavo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
