197354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó streptomyces kiválasztására.
24 197354 25 ezután kinyerjük és az etidium-bromidot, valamint a céziura-kloridot hagyományos módszerekkel eltávolítjuk. Az ezzel az eljárással nyert minegy 1 mg pKC331 fazmid DNS-t feloldjuk 1 ml TE pufferben (10 mmól/liter Trisz-HCl, pH 8, és 1 mmól/liter EDTA) és -20 °C hómérsékleten tároljuk. 9. példa A pSVB 3310 tág megalkotása A. A pKC331 fazmid emésztése Pst I-el és a mintegy 37 kb-s Pst I restrikciós fragmens izolálása Mintegy 10 Mg (10 m1)> a 8. példa szerint izolált pKC 331 fazmidot adunk 10 m1 10 szeres Pst I sóhoz, 2 pl Pst I restrikciós enzimhez (kb. 10 egység) és 78 pl vízhez. Enyhe keverés után az emésztendő keveréket 2 órán át hagyjuk reagálni 37 °C hőmérsékleten. Emésztés után a 0C31 fág szekvenciákat tartalmazó, mintegy 37 kb-s Pst I fragmenst hagyományos gélelektroforézises módszerrel tisztítjuk. A nyert tisztított fragmenst (mintegy 5 Mg) 5 m1 TE pufferban szuszpendáljuk. B. A mintegy 3,8 kb-s tilozin-rezisztencia-étvivó Pst I restrikciós fragmens ligálása a pKC331 fazmid mintegy 37 kb-s Pst I restrikciós fragmenséhez A ligálást lényegében a 3 C.) példában leirt módszerrel összhangban hajtjuk végre azzal a kivétellel, hogy más restrikciós fragmenseket alkalmazunk. Ebben a ligálásban 2,5 m1, a 9 A.) példa szerint készített mintegy 37 kb-s Pst I restrikciós fragmenst ligálunk 2 m1» a 4 A.) példa szerint nyert fragmenshez, hogy a kívánt pSVB3310 és PSVB3311 fágokat nyerjük. A pSVB3311 fág csupán a mintegy 3,8 kb-s Pst I fragmens orientációja szempontjából különbözik a PSVB3310 fágtól [lásd 9.) és 10.) ábra]. A ligáit DNS-t alkalmazzuk Streptomyces transzformálására, hogy fertőzni képes fág-részecskéket nyerjünk. Ezeket a fág-részecskéket alkalmazzuk ezután tilozin-rézisztens Streptomyces készítésére a vektor kromoszomális intergálása útján. 10. példa A Streptomyces lividans/pSVB3310 megalkotása A 9 B.) példa szerinti ligáit DNS-t, 200 m1 Streptomyces lividans protoplasztot, 10® Streptomyces lividans spórát és 500 m1 55%-os polietilénglikolt (P tápközegben) Vortex-berendezésben összekeverünk, és 25 m1- -es, illetve 250 mI-cs alikvotokat helyezünk R2YE lemezekre, amelyek 3 ml R2ŸE felső agart tartalmaznak. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A tarfoltokat általában a 20. óra után lehet észlelni. Miután a tarfoltok feltűnnek, ezeket eltávolítjuk a lemezről és a fág-részecskéket kimossuk az agárból TSB tápközegbe. A fág-szuszpenzió sorozathigitását készítjük el és alikvotokat veszünk ki, amelyeket 10® Streptomyces lividans spórával keverünk össze. Ezeket a hígításokat abból a célból készíthetjük, hogy jó tarfolteloszlást érjünk el a lemezen. A keverékeket R2YE lemezekre helyezzük és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, amig a spóraképződés bekövetkezik, ez a folyamat mintegy 4 napig tart. A spóra-képződés után a lemezeket replika-módszerrel átvisszük friss R2YE lemezekre, amelyek 500 Mg/ml tilozint is tartalmaznak. A replika-lemezeket azután 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 3-4 napig, és az igy létrejött S. lividans/pSVB3310 tilozin-rezisztens telepeket ismert módszerek szerint izoláljuk, tenyésztjük és azonosítjuk. A 10. példa előző részében levő kitanitással összhangban megalkotott reprezentatív transzfektánsokat foglalja magában a 3. Táblázat. A találmány természetesen nemcsak ezekre korlátozódik. 3. Táblázat Reprezentatív transzfektánsok 1.) Streptomyces R/R1, ahol R jelentése ambofaciens, griseofuscus és lividans és R1 jelentése egymástól függetlenül valamely fág PKC3310 és pKC3311 közül. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó Streptomyces gazdasejt kiválasztására azzal jellemezve, hogy- egy tilozinra érzékeny, restrikció nélküli Streptomyces gazdasejtet, amely fogékony transzformációra, sejtosztódásra és tenyésztésre, a gazdasejtben önálló replikálódásra és integrálódásra képes rekombináns DNS klónozó vektorral transzformálunk, ahol is az említett vektor olyan DNS szekvenciát tartalmaz, amely tilozinra való rezisztenciát visz át, és- a transzformált sejteket a tilozin-rezisztenciára való kiválasztáshoz alkalmas körülmények között növesztve tenyésztjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy vektorként valamilyen plazmidot alkalmazunk. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy plazmidként a pSVB2, pSVB12, pSVB23, pSVB16, pSVB18, pSVB20 vagy pSVB22 plazmidot alkalmazzuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
