197354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó streptomyces kiválasztására.
22 197354 23 Bzetbôl származó micéliumot szuszpendálunk 3-4 ml L tápközegben és inkubáljuk 1 órán át 32 °C hómérsékleten. Ennek az időtartamnak a folyamán a szuszpenziót egyszer vagy kétszer föl-le pipettázzuk, hogy szétoszlassuk a csomókat. 5 ml P tápközeget adunk hozzá, majd a szuszpenziót egy nyerBgyapot dugón átszűrjük. A protoplasztokat centrifugálással kinyerjük (800 g-nál 10 percen át), és kétszer mossuk 5 ml P tápközeggel. A protoplasztokat ezután 4 ml P tépközegben szuszpendáljuk és a protoplasztok számát mikroszkóposán meghatározzuk, heraacitométer lemezt alkalmazva. Ha a protoplasztokat nem akarjuk azonnal felhasználni, a szuszpenziót alikvotokra (kb. 1 ml) osztjuk szét steril polipropilén, csavaros kupakú csövekbe, minden alikvot S.IO^IO10 protoplasztot tartalmaz. A szuszpenziókat lassan lefagyasztjuk a csöveket jéggel teli tartályba helyezve, amelyet azután -70 °C hőmérsékletre helyezünk. A protoplasztokat ezen a hőmérsékleten tároljuk, amíg szükséges. A fagyasztott szuszpenziókat gyorsan engedtetjük fel használat előtt, 37 °C hőmérsékletű vízfürdőbe merítve. B. Protoplaszt transzformálás Mintegy 5.1099 protoplaszt-szemcsét nyerünk ki centrifugálással (800 g-nál 10 percen át). A felülúszót dekantáljuk és a protoplasztokat újra szuszpendáljuk a csőben maradt kis térfogatú folyadékban. Nem több, mint 20 m1 térfogatú, TE pufferban levő plazmld DNS-t adunk hozzá, majd azonnal ez után 0,5 ml T tápközeget adunk hozzá. A keveréket egyszer vagy kétszer fel és le pipettázzuk, hogy a tartalmat összekeverjük. Ennél a pontnál a szuszpenziót vagy rögtön lemezre helyezzük, vagy 0,5 ml P tápközeggel hígítjuk és azután helyezzük lemezre. Mindkét esetben kb. 0,1 ml-t inokulálunk R2YE tápközeg-lemezenként. Tilozin-rezisztens transzformánsokat választunk ki olyan módon, hogy a regenerált protoplasztokat replika-lemez módszerrel 500 Mg/ml tilozint tartalmazó R2YE tápközegre visszük át. Egy másik módszer szerint a tilozin-rezisztens transzformánsokat úgy választhatjuk ki, hogy a regenerálódó protoplasztokat lágy, tilozint tartalmazó .Nutrient broth’ (tápközeg) agarral (SNA) rétegezzük felül. A regenerálódásra szolgáló lemezeket 16-22 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, mielőtt a 2,5 ml/lemez SNA-t (45-50 °C) alkalmaznánk; az SNA annyi tilozint tartalmaz, hogy a diffúzió után a lemez végső koncentrációja 500 Mg/ml legyen. A pIJ702 származékokat hordozó transzformánsok által végzett melanin-termelést, vagy annak hiányát úgy határozhatjuk meg, hogy 750 Mg/ml koncentrációban tirozint építünk be az SNA felülrétegező anyagba; azok a transzformánsok, amelyek rendelkeznek az érintetlen tirozináz génnel, feketévé válnak növekedés után tilozin jelenlétében. C. A S. lividans transzformánsok elemzése A fentiek szerint létrejött transzformánsokat lényegében a 6 D.) példa szerinti kitanitéssal összhangban elemezzük. 8. példa E. coli K12 BE44 7/pKC331 tenyésztése és a pKC331 fazmid izolálása A. E. coli K12 BE447/pKC331 tenyésztése E. coli K12 BE447/pKC331 (NRRL B-15 828) 2 ml-es tenyészetét növesztjük 50 Mg/ml ampicillin jelenlétében TY tépközegben (1% tripton, 0,5% NaCl és 0,5% élesztőkivonat, pH 7,4). Ezt a 2 ml-es tenyészetet alkalmazzuk ezután egy lombik inokulálására, amely 1 liter 50 Mg/ml ampicillint is tartalmazó TY tápközeget tartalmaz, majd a növesztést addig folytatjuk, amíg a tenyészet optikai sűrűsége 550 nanométernél (OD 550) 0,50 és 0,75 abszorpciós egység között lesz. Amikor az OD 550 eléri a 0,50-0,75 tartományt 1 g uridint adunk a tenyészethez, és 15 perccel később 170 mg klóramfenikolt adunk hozzá. Az inkubálást és tenyésztést ez után még 16 órán át folytatjuk. B. A pKC331 fazmid izolálása A tenyészetet centrifugáljuk és a sejt-szemcséket újra szuszpendáljuk 10 ml következő összetételű oldatban: 25% szacharóz (súly/térfogat): 50 mmól/liter Trisz-HCl, pH 8; és 1 mmól/liter EDTA. Ez után 2 ml 0,5 mól/literes EDTA oldatot és 2 ml, 0,25 mól/literes Trisz-HCl-ben levő 5 mg/ml-es lizozim-oldatot adunk hozzá, és az Így létrejött keveréket szobahőmérsékleten inkubáljuk 15 percen át. Az inkubálás után kb. 14 ml kővetkező összetételű oldatot adunk hozzá: 50 mmól/liter Trisz-HCl, pH 8; 6 mmól/liter EDTA; és 0,1% Triton X-100. A lizozimmel kezelt sejteket ezután megfordítással összekeverjük. A lizált sejtkeveréket addig centrifugáljuk, amig a sejtüledék laza szemcséket képez. Miután a sejtüledéket eldobtuk és a felülúszót pufferolt (pH 8) fenollal extraháltuk, a vizes fázishoz NaCl-t adunk 0,5 mól/liter koncentrációig, majd két térfogat etanolt adunk hozzá. Az igy létrejött keveréket -70 °C hőmérsékletre fagyasztjuk, és a nukleinsavak szemcséit centrifugálással kinyerjük. További centrifugálást hajtunk végre (45 000 ford./perc 16 órán ét 20 °C hőmérsékleten) a fazmid DNS tisztítása érdekében, cézium-klorid gradienst alkalmazva etidium-brcmiddal. A kivánt pKC331 fazmid DNS-t 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
