197354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó streptomyces kiválasztására.
20 197354 21 mérsékleten. A fagyasztott sejteket felengedtetjük olyan módon, hogy a csövet szobahőmérsékleten egy főzőpohár vízbe helyezzük. A sejteket ezután kinyerjük asztali centrifugában és háromszor mossuk 10 ml 10,3%-os szacharóz oldattal. A sejt-szemcséket újra szuszpendáljuk 1 mg/ml lizozimmal kiegészített P tápközegben és inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten két órán át. A keveréket azután centrifugáljuk, hogy a protoplaszt-szemcséket kinyerjük. A szemcséket háromszor mos- Buk 10 ml P tápközeggel, és a szemcséket vortex-készülékkel visszük oldatba minden mosásnál. A protoplasztokat végül újra BZUBzpendáljuk 2 ml P tápközegben az ez után következő transzformáláshoz. C. Transzformálás Mintegy 10 pl, ligáló pufferben levő plazmid DNS-t és mintegy 150 m1 Streptomyces griseofuscus protoplasztot összekeverünk egy kémcsőben, majd 101 jul 50%-os PEG1000- -t (P tápközegben) adunk hozzá. 1-2 perc várakozás után annyi P tápközeget adunk hozzá, hogy a térfogat 1 ml legyen. A transzformált sejteket R2 lemezre visszük ki és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 7-10 napon át. 50 Mg/ml tilozint tartalmazó YMX tápközegre replika-lemezeket készítünk hogy azonosítsuk a transzformánsokat. Egy másik módszer szerint a transzformánsokat közvetlenül is ki lehet választani, a lemezeket - egy éjszakán át 30 °C hőmérsékleten történt inkubálás után - felülrétegezve lágy R2 tápközeggel, amely annyi tilozint tartalmaz, hogy a végső lemez-koncentráció 50 Mg/ml tilozin legyen. Az Így létrejött tilozinrezisztens S. griseofuscus telepeket ismert módszerek szerint lehet izolálni, tenyészteni, majd könnyen azonosítani, amint ezt az alábbiakban leirjuk. A transzformáns-tenyészetet lehet használni azután a plazmid DNS ezt követő termeléséhez és izolálásához. D. A Streptomyces griseofuscus transzformánsok elemzése Az előbbiek szerint létrejött transzformánsokat 50 Mg/ml tilozinnal kiegészített YMX agáron tenyésztjük, hogy egyedi telepeket nyerjünk. Ezeket az egyedi telepeket alkalmazzuk 10 ml-es. .TSB-tenyészetek inokulálására, amelyek szintén tartalmaznak tilozint (10 Mg/ml). A tenyészeteket homogenizáljuk, majd egy éjszakán át növesztjük 30 °C hőmérsékleten forgó rázógépen. A plazmid-izolálást elemzéshez úgy végezzük, mint az 1. példában leirt folyamat kisléptékű változatát; az 1. példában szereplő CsCl gradienst etanolos kicsapással helyettesítjük. A micéliumot centrifugálással összegyűjtjük, kétszer mossuk 10,3%-os szacharóz-oldattal. A sejtkeverékből 400 ul-t étviszünk egy kis csőbe, és 100 m! 5-szörös lizozim-oldatot (lásd 1. példa) adunk hozzá. A szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 30-60 percen át, majd hozzáadunk 250 m1» 1* SDS-t tartalmazó 0,3 mól/literes NaOH oldatot, és összekeverjük. Az utóbbi oldatot 50 °C hőmérsékleten tartjuk, mielőtt hozzáadnánk a sejtkeverékhez. Miután a sejtkeveróket 80 °C hőmérsékletre helyeztük 10 percre, majd szobahőmérsékletre lehűtöttük, a mintát 100 m1 fenol-kloroform (50:50) eleggyel extraháljuk. A vizes fázist tiszta csőbe visszük, NaOAc-ot adunk hozzá 0,3 mól/liter koncentráció eléréséig, majd egy térfogat izopropanolt adunk hozzá. Miután öt percig BzobahőmérBékleten tartottuk, a DNS szemcséket centrifugálással kinyerjük. A szemcséket 400 m! TE pufferban feloldjuk, és NaOAc-ot adunk hozzá 0,3 mól/liter koncentráció eléréséig. Mintegy 2,5 térfogat etanolt adunk hozzá, ezt követően 30 percen át -70 °C hőmérsékleten fagyasztjuk. Centrifugálás és újabb kicsapás után a DNS-t 50 m1 TE pufferban szuszpendáljuk. A reakcióterméket restrikciós enzim-hasítási és elektroforetikus elemzését használjuk fel, hogy meghatározzuk a plazmid szerkezetét. E. Streptomyces griseotuscus/pSVB2, S. griseofuscus/pSVB12, S. griseofuscus/ /pSVBlß, S. griseofuscus/pSVBIß, S. griseofuscus/pSVB20, S. griseofuscus/ /pSVB22 és S. griseofuscus/pSVB23 készítése A fenti konstrukciók mindegyikét külön-külön az ennek a Példának az előző részeiben leirt kitanitással összhangban készítjük el és elemezzük. 7. példa Tilozin-rezisztens Streptomyces lividans/pSVB12, S. lividans/pSVB16, S. lividans/pSVB18, S. lividans/pSVB20, S. lividans/pSVB22 és S. lividans/pSVB23 megalkotása Az alábbi módszert alkalmazzuk a Streptomyces lividans transzformánsok megalkotására és elemzésére. A pSVB12, pSVB16, pSVB18, pSVB20, pSVB22 és pSVB23 plazmidok mindegyikét külőn-külön és függetlenül alkalmazzuk, mint a DNS transzformálóit. A. Protoplasztok készítése és támlása Streptomyces lividans TK23-at (NRRL 15 826) növesztünk 40-48 órán át 30 °C hőmérsékleten YEME tápközegben, amely még 34% szacharózt, 5 mmól/liter MgCk-t és 0,5% glicínt is tartalmaz. A micéliumot centrifugálással nyerjük ki (800 g-nél 10 percen át asztali centrifugában) és kétszer mossuk 10,3%-os szacharóz oldattal. 25-50 ml tenyé-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
