197352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pHJL 210 plazmid és más, ezzel összefüggő kétfunkciós klónozó vektorok előállítására Streptomycetesben való alkalmazáshoz
14 197352 15 hidrolizált tejfehérje, Dífco), 2 ug/ml Bi vitaminnal (tiamin-HCl, Sigma) és adalékokkal kiegészítve, inokulálunk 5 ml éjszakán át nőtt tenyészettel. A tenyészetet élénk rázatás mellett inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át, és a következő reggelen az éjszaka nőtt tenyészet mintáit inokuláljuk 1/10 és 1/50 közti hígításokban a kiegészített M9 tápközegbe és inkubáljuk élénk rázatás közben 37 °C hőmérsékleten 2,5-3 órán át. A tenyészet turbiditása kék szűrővel mérve 300-400 Klett-egység. Klóramfenikolt (150-175 Mg/ml) adunk a tenyészethez és az inkubálást élénk rázatás mellett folytatjuk egy éjszakán át. A baktériumsejteket centrifugálással nyerjük ki 7500 fordulat/percné) 5 percen ét 4 °C hőmérsékleten, majd kétszer mossuk 200 ml SV-vel (0,15 mól/liter NaCl, 0,1 mól//liter EDTA-nátriumsó, pH 8,0). A szemcséket 10 ml/g nedves súly TS oldatban újra szuszpendáljuk (25% szacharóz, 50 mmól/liter Tris, pH 8) és jégbe helyezzük. Ehhez a szuszpenzióhoz 2 ml/g nedves súly lizozim-oldatot adunk (5 mg/ml 50 mmól/literes Trís-HCl-ben, pH 7,8) és hagyjuk a jégben lehűlni 5 percen át. Ezután 4 ml/g nedves súly 0,25 mól/ /liter EDTA-t (pH 8,0) adunk hozzá és további 5 percen át hütjük. 16 ml/g nedves súly lizáló oldat hozzáadása után (0,4% dezoxikolát, 1% Brij 58, 50 mmól/liter Tris és 0,0625 mól/liter EDTA, pH 8) a keveréket 37 °C hómérsékleten 15-30 percen át inkubáljuk. A DNS-t centrifugálással kinyerjük Sorvall SS34 rotorban 21 000 fordulat/percnél 15-30 percen át 4 °C hőmérsékleten. A felülúszót megőrizzük és 0,1 térfogat 3 mól/ /literes NaOAc oldatot és 0,64 térfogat izopropanolt adunk a felülúszóhoz. A DNS-t 10 000 fordulat/perccel 10 percen át 4 °C hőmérsékleten centrifugáljuk, majd ezután a szemcséket újra szuszpendáljuk 0,1 térfogat TE-ben (10 mmól/liter Tris, 1 mmól/liter EDTA, pH 8). A plazmid DNS-t centrifugálással tisztítjuk, propidium dijodidot tartalmazó céziumklorid sűrűség-gradiensekben kiegyensúlyozva ismert technikák szerint. 2. példa A Streptomycetesben működő pHJL2200, PHJL2201, pHJL2202 és pHJL2203 plazmidok megalkotása A. A pJL192 plazmid emésztése és a replikációt tartalmazó restrikciós fragmens mintegy 2,5 kb-s kiindulásának izolálása Mintegy 20 m1 (20 Mg) pJL192 plazmid DNS-t, 5 ul BSA-t (szarvasmarha szérum albumin, 1 mg/ml), 19 pl vizet, 1 pl (8 egység/ml) Kpnl restrikciós enzimet* és 5 pl reakciókeveréket** inkubálunk 37 °C hőmérsékleten 2 órán át, majd az inkubálást 70 °C hőmérsékleten 10 percen át történő melegítéssel fejezzük be. A DNS-t 0,1 térfogat 3 mól/literes NaOAc oldattal (pH 8), majd két térfogat 100%-os etanollal csapjuk ki. A kicsapást végezhetjük vagy -20 °C hőmérsékleten egy éjszakán át, vagy -70 °C hőmérsékleten (száraz jégen) legalább 15 percen át. A DNS csapadékot egyszer hideg 70%-os etanollal mossuk, majd megszáritjuk és újra szuszpendáljuk 50 ml TE-ben (10 mmól/liter Tris, 1 mmól/liter EDTA, pH 8,0). Az így létrejött DNS-t elektroforézisnek vetjük alá vízszintes agaróz gélben egyszeres TBE pufféiban (89 mmól/liter Tris-HCl, pH 8,3, 89 mmól/liter bórsav, 2,5 mmól/litert EDTA) lényegileg összhangban Maniatis és munkatársainak kitanitásával [Molecular Cloning (Molekuláris klónozás), Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, 1982]. * A restrikciós enzimek és az útmutatások a következő forrásokból szerezhetők be: few England Bio Labs., Inc., 32 Tozer Road Beverly, Massachussets 01915, Amerikai Egyesült Államok. Boehringer-Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Drive P. 0. Box 50816, Indianapolis, Indiana 46250, Amerikai Egyesült Államok. Bethesda Research Laboratories Inc., 8717 Grovemont Circle, P. 0. Box 577, Gaithersbury Maryland 20760, Amerikai Egyesült Államok. ** A KpnX restrikciós enzimhez szolgáló reakciókeveréket a következő összeállításban készítjük el: 60 mmól/liter NaCl 63 mmól/liter Tris-HCl, pH 7,5 60 mmól/liter MgClz 60 mmól/liter 2-merkapto-etanol Az elkülönített fragmenseket lokalizáljuk a gélben etidium-bromiddal történő festéssel és a Fluorencens csíkok láthatóvá tételével ultraibolya fénnyel. A kívánt mintegy 2,5 kb-s csíkkal határosán egy szeletet készítünk és DEAE cellulóz (Whatman DE-81) papirt helyezünk el a hasítékban. A DNS-t addig vetjük alá elektroforézisnek, amíg a DNS teljesen rá nem kötődött a papírra. Az eltávolítás után a papirt 100 mmól/liter KCl-ből és 10 mmól/liter Tris-HCl-ből (pH 8) álló oldatban egyszer mossuk, és 5 ml elúciós pufferben (1 mól/liter NaCl és 10 mmól/liter Tris-HC1, pH 8) diszpergáljuk élénk keverés mellett. A papírt szűréssel eltávolítjuk szilikonozott Pyrex-üvegszöveten át és a DNS-t vagy közvetlenül kicsapjuk 2 térfogat etanollal, vagy hígítjuk 1 térfogat vízzel, és ezt követően végezzük el az etanolos kicsapást. A kicsapás bármelyik módszerét száraz jégen át lehet végrehajtani egy órán át, vagy egy más módszer szerint -20 °C hőmérsékleten 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
