197352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pHJL 210 plazmid és más, ezzel összefüggő kétfunkciós klónozó vektorok előállítására Streptomycetesben való alkalmazáshoz
16 197352 17 egy éjszakán át. A kicsapást követően a fragmenseket újra feloldjuk 100-500 ml TE pufferban az ezt követő összekapcsoláshoz (ligáláshoz). B. A pLR2 plazmid emésztése és tiosztrepton-rezisztencia átadó fragmensének izolálása Mintegy 20 pg pLR2 plazmid (amelyek megalkotását a 4 416 994 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás tárja fel, és amely ide referenciaként van beépítve) DNS-t emésztünk Baml* restrikciós enzimmel, amely négy helyen hasítja el a pl&zmidot. A BamI-vel képzett végeket betöltjük Klenow polimeráz I-el, amint ezt Maniatis és munkatársai leírták (1982). Ezeket a tompa végű fragmenseket ezután egyesítjük Kpn I kapcsolókkal [amelyek a pCGGTACCG szekvencia önmagával komplementer oligonukleotidjából áll, és amely a Collaborative Research, Inc.-nél kapható (128 Spring Street, Lexington, Massachussets 02173, Amerikai Egyesült Államok)], Kpn I hasítási helyet szolgáltatva a pJL192 plazmid replikációt tartalmazó fragmensének mintegy 2,5 kb-s Kpn I kiindulásához való ligálásához. A pLR2-ből nyert DNS fragmens 20 pg-ját 10 egység T4 DNS ligázzal** kezeljük 200 pikomól pCGGTACCG ő’-foszforilezett szintetikus oligonukleotid jelenlétében és 20 pl T4 DNS ligáz pufferban (20 mmól/liter Tris, pH 7,6 0,5 mmól/liter ATP, 10 mmól/liter MgCk, 5 mmól/liter ditiotreitol) 20-22 °C hőmérsékleten egy éjszakán át. Az oldatot azután 10 percen át melegítjük 70 °C hőmérsékleten a ligálás megállítására. A kapcsolókat Kpn I emésztéssel elhasitjuk és a fragmenseket, most Kpn I végekkel, elkülönítjük 1X-OB AGE-val (agaróz-gél elektroforézis). A mintegy 1,6 kb-s fragmenseket izoláljuk a gélről először megfestve etidiura bromiddal, majd a fragmenseket ultraibolya fénnyel lokalizálva és papíron eluálva, amint ezt a 2 A példában korábban leírtuk. * A BamHI restrikciós enzimhez való reakciókeveréket a következő összeállításban készítjük el: 1,5 mól/liter NaCl 60 mmól/liter Tris-HCl, pH 7,9 60 mmól/liter MgCh ** A T4 DNS ligázt a következő forrásokból szerezhetjük be: New England Bio Labs., Inc., 32 Tozer Road Beverly, Massachussets 01915, Amerikai Egyesült Államok. Bethesda Research Laboratories. P.O.Box 577 Gaithersburg, Maryland 20760, Amerikai Egyesült Államok. Boehringer-Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Drive, P.O.Box 50816, Indianapolis, Indiana 46250, Amerikai Egyesült Államok. C. Ligálás a pHJL2200 és pHJL2201 plazmidok képzésére Mintegy 20 pl, pJL192 plazmid DNS mintegy 2,5 kb-s Kpn I fragmenst, 20 pl, pLR2 plazmid DNS mintegy 1,6 kb-s BamHI fragmenst (2 B példa), 10 pl 5-szörős kináz/lígáz puffert (4 B példa), és 1 pl T4 DNS ligázt inkubálunk 16 °C hőmérsékleten 4 órán át. A ligálás termékét azután közvetlenül használjuk a Streptomycetes transzformációjában. A pHJL2200 és pHJL2201 plazmidok restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 2. ábra mutatja be. D. A pHJL 2200 plazmid részleges Bel I emésztése A kívánt emésztést lényegileg a 2 A példában található kitanítással összhangban végezzük el, kivéve, hogy pHJL 2200 plazmidot, Bel I restrikciós enzimet és reakciókeveréket* használunk a pJL192 plazmid, Kpn I restrikciós enzim és reakciókeverék helyett. Ezen kívül a reakciót 50 °C hőmérsékleten hajtjuk végre, és a leállítást kétszeres fenolos extrakcióval, háromszoros éteres extrakcíóval, és etanolos kicsapással végezzük, majd a csapadékot vízben újra szuszpendáljuk az ezt követő AGE kezeléshez. * A Bel I-hez való reakciókeveréket a következő összeállítás szerint készítjük el: 750 mmól/liter KC1, 60 mmól/liter Tris-HCl, pH 7,4 25 “C hőmérsékleten, 100 mmól/liter MgCte 10 mmól/liter ditiotreitol E. A pLR4 plazmid emésztése és mintegy 3,4 kb-s BamHI fragmensének izolálása A kívánt emésztést lényegében a 2 A példában található kitanítással összhangban végezzük el azzal a kivétellel, hogy pLR4 plazmidot (amelynek megalkotását a 4 416 994 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás tárja fel, és amely ide referenciaként van beépítve) és BamHI restrikciós enzimet alkalmazunk pJL192 plazmid és Kpn I restrikciós enzim helyett. F. Ligálás a pHJL2202 és pHJL2203 képzésére A kívánt ligálást lényegileg a 2 C példában található kitanítás szerint hajtjuk végre. Négy orientációjú rekombináns plazmidokat a kivánt fenotipussal lehet előállítani, mivel a mintegy 3,4 kb-s BamHI neomicin rezisztencia átadó fragmenst bármilyen irányban lehet orientálni a két BamHI hely egyikénél a pHJL2200 plazmidban. A pHJL2202 és pHJL2203 plazmidok restrikciós hely- és működési térképét a 3. ábra mutatja be a mellékelt rajzok közül. 5 10 15 20 25 30 35 4C 45 50 55 60 65 10
