197352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pHJL 210 plazmid és más, ezzel összefüggő kétfunkciós klónozó vektorok előállítására Streptomycetesben való alkalmazáshoz
12 197352 13 bői. így a jelen találmány szerinti vektorok stabilizálhatják és fenntarthatják bármelyik szóban forgó DNS szekvenciát, hacsak a klónozott DNS vagy egy kifejezett termék nem haláloB a gazdasejtre. A jelen találmány szerinti klónozó vektorok és transzformánsok a gének klónozásához szolgálnak, hogy növeljék a különböző termékek kitermelését, amelyek a Streptomycetesben és rokon sejtekben jelenleg termelődnek. Az ilyen termékekre példák (bár nem korlátozódnak csak ezekre) pl. a kővetkezők: sztreptomicin, tilozin, cefalosporinok, aktaplanin, avoparcin, narasin, monenzin, apramicin, tobramicin, eritromicin, tetraciklin, klóramfenikol, vankomicin, teikomicin, és hasonlók. A jelen találmány kiválasztható vektorokat is nyújt, amelyek alkalmazhatók DNS szekvenciák klónozására, jellemzésére és újra helyreállítására, olyan DNS szekvenciáké, amelyek kereskedelmileg fontos fehérjéket kódolnak, mint pl. humán inzulin, humán proinzulin, glukagon, interferon, humán növekedési hormon, madár növekedési hormon, szarvasmarha növekedési hormon, sertés növekedési hormon, interleukin I. interleukin II, és hasonlók; enzimes funkciókat kódolnak metabolikus utakon, amelyek kereskedelmileg fontos folyamatokhoz és vegyületekhez vezetnek; vagy szabályozó elemeket kódolnak, amelyek javítják a gén-kifejeződést. Ezek a kívánt DNS szekvenciák magukban foglalják (de nem korlátozódnak csak ezekre) azokat a DNS-eket, amelyek olyan enzimeket kódolnak, amelyek katalizálják a leszármaztatott antibiotikumok szintézisét, pl. a sztreptomicin, cefalosporin, tilozin, aktaplanin, avoparcin, narasin, monenzin, apramicin, tobramicin, tetraciklin, klóramfenikol, eritromicin, teikomicin, és vankomicin származékok szintézisét, vagy olyan enzimeket, amelyek közvetítik és növelik az antibiotikumok vagy más termékek bioprodukcióját. A fentebb emlitett DNS szegmenések beiktatási, stabilizálási és áthelyeződésí képessége Streptomycetesbe és E. coliba lehetővé teszi a könnyű rekombináns genetikai manipulációt a Streptomycetes által termelt antibiotikumok kitermelésének és hozzáférhetőségének növeléséhez. Ezen kívül mivel a PJL192 plazmid replikációt tartalmazó fragmensének mintegy 2,5 kb-s Kpnl kiindulása nagy kópiaszámú plazmidot állít elő, csaknem minden olyan DNS szekvenciát, amely gyengén van átírva vagy átfordítva, könnyen klónozni lehet a jelen vektorokba és áthelyezni a Streptomycetes és az E. coli között. Az Escherichia coli K 12 C600Rk-Mk-/ /pJL192 (NRLL B-15040) törzset számtalan módon lehet tenyészteni, a számos különböző tápközeg bármelyikét alkalmazva. A tápközegben előnyös szénhidrát források lehetnek pl. a glükóz és a glicerin, és a nitrogén-források lehetnek pl. az ammóníum-sók, aminosav-keverékek, és peptonok. Tápközegként 8 szolgáló szervetlen sókat szintén építünk be, amelyek a szokásos olyan sók lehetnek, amelyek képesek magnézium, nátrium, kálium, ammónium, kalcium, foszfát, klorid, szulfát és hasonló ionokat termelni. Amint ez más mikroorganizmusok növekedéséhez és kifejlődéséhez is szükséges, esszenciális nyomelemeket szintén kell adni. Az ilyen nyomelemek általában a más tápközeg-alkotórészek adásánál véletlenszerűen előforduló tiszta talanságok szolgáltatják. Az E. coli K 12 C600Rk-Mk-/pJL192-t aerob tenyésztési körülmények között lehet növeszteni viszonylag széles pH-tartományban, pH 6,5-7,5 között, kb. 25° és 42 °C közötti hőmérsékleten. A legnagyobb mennyiségű pJL192 plazmid előállításhoz azonban kívánatos, hogy a tenyésztő tápközegnél kb. pH 7,2-vel induljunk, és a tenyészet hőmérsékletét 37 °C hőmérsékleten tartsuk fenn. Az E. coli sejteket a fentebb említett körülmények között tenyésztve a sejtek tárolóhelye jön létre, amelyekből a pJL192 plazmid a szakterületen ismert technikákkal izolálható. Azt ábrák rövid leírása a kővetkező: Az 1. ábra a pJL192 plazmid restrikciós hely térképét mutatja be. A 2. ábra a pHJL2200 és pHJL2201 plazmidok restrikciós hely- és működési térképe. A 3. ábra a pHJL2202 és pHJL2203 plazmidok restrikciós hely- és működési térképe. A 4. ábra a pHJL201 plazmid restrikciós hely- és működési térképe. Az 5. ábra a pHJL200, pHJL202, pHJL203, PHJL204 és pHJL205 plazmidok restrekciós hely- és működési térképe. A 6. ábra a pHJL210 és pHJL211 plazmidok restrikciós hely- és működési térképe. A most következő példák tovább illusztrálják és részletezik az itt közölt találmányt. A találmány megalkotásához szükséges magyarázatokat és aktuális folyamatokat is leírjuk, ahol szükséges. 1. példa Az E. coli K 12 C600Rt-Mk-/pJL 192 tenyésztése és a pJL 192 plazmid izolálása E. coli K 12 C600Rn-Mk-/pJL192 (NRRL B-15 040) egyedi baktérium-telepet inokulálunk LB tápközegbe, amely 1 liter vizes oldatban 10 g Bac to triptont, 5 g Bac to élesztőkivonatot, és 10 g NaCl-t tartalmaz (pH 7,5) 25 Mg/ml ampicillinnel együtt, a hagyományos mikrobiológiai eljárások szerint. A tenyészetet 37 °C hőmérsékleten 1 éjszakán át inkubáljuk. A kővetkező reggelen 500 ml M9 tápközeget [Miller és munkatársai: Experiments in Molecular Genetics (Kísérletek a molekuláris genetikában), Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, 1979], 1 mmól/liter MgSCM-el, 0,2% glükózzal, 0,3-0,4% CAA-val (casamino acid, részben 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
