197352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pHJL 210 plazmid és más, ezzel összefüggő kétfunkciós klónozó vektorok előállítására Streptomycetesben való alkalmazáshoz
10 197352 11 és pHJL211; és előnyös transzformánsok: Streptomyces griseofuscus (pHJL2200, S. griseofuscus) pHJL2202, S. lividans (pHJL201, S. lividans) pHJL210, S. lividans (pHJL211, S. griseofuscus) pHJL.210, S. griseofuscus (pHJL210| S. griseofuscus) pHJL211, S. fradiae (pHJL201, S. fradiae) pHJL210, S. fradiae (pHJL211, E. coli K 12 C600Rk-Mk-) PHJL201, E. coli K 12 C600Rk-Mk-(pHJL210, és E. coli K 12 C600Rk-Mk-)pHJL211. Ebből az előnyös csoportból a legelőnyösebbek a pHJL201, pHJL210 és pHJL211 plazmidok és a S. griseofuscus (pHJL201, S. griseofuscus) pHJL 210, S. griseofuscus (pHJL211, E. coli K 12 C600Rk-Mk-) pHJL201, E. coli K 12 C600Rk-Mk- (pHJL210 és E. coli K 12 C600Rk- Mk-)pHJL211 transzformánsok. A jelen találmány szerinti vektorok magukban foglalnak replikációs kiindulást, amely működőképes E. coliban és Streptomycetesben egyaránt és ezáltal nagy rugalmasságot enged meg a gazdaszervezet kiválasztásában. Kővetkezpésképpen a klónozott DNS szekvenciákat át lehet vinni E. coli-ba új plazmidok képzésére, fizikai analízisre és a restrikciós helyek feltérképezésére, majd vissza lehet vinni Streptomycetesbe működési elemzésre és a törzs feljavítására. Ez különösen előnyös, mivel a plazmidok sokszorozását és manipulálását gyorsabban és kényelmesebben lehet elvégezni E. coliban, mint Streptomycetesben. így pl. a jelen vektorokat hagyományosan lehet sokszorozni E. coli K 12-ben spektinomicinnel vagy klóramfenikollal való növesztéssel. Ez nem lehetséges a Streptomycetes gazdaszervezet-rendszerben. Ezen túl, mivel minden plazmid vektor tartalmaz rezisztencia markereket, amelyek kifejeződnek E. coli K 12-ben, rekombinánsokat könnyen ki lehet választani. Ennél fogva nagy mennyiségű plazmid DNS-t lehet izolálni kényelmesen és rövidebb idő alatt, mint amennyi szükséges lenne hasonló műveletekhez Streptomyceteshez. A jelen találmány szerinti rekombináns DNS klónozó vektorok és transzformánsok széles körű alkalmazást nyerhetnek és segíthetnek kielégíteni az igényt megfelelő klónozó hordozókra Streptomycetesben és rokon organizmusokban való felhasználáshoz. Ezen felül a jelen vektoroknak az a képessége, hogy antibiotikumokra való rezisztenciát adnak át, szintén működési segítséget nyújt a transzformánsok kiválasztásához. Ez fontos az olyan sejtek meghatározásához és kiválasztásához való gyakorlati szükségszerűség miatt, amely sejtek befogadják a vektor DNS-t. További DNS szegmensek, amelyek jelenlétében hiányzanak a működési vizsgálatok, szintén beiktathatok a jelen vektorokba és ez után a nem-kiválasztható DNS-t tartalmazó transzformánsok is izolálhatók a megfelelő antibiotikum-szelekcióval. Ilyen nem-kiválasztható DNS szegmensek beiktathatok bármilyen helyre, kivéve a plazmid működéséhez, fenntartásához és replikációjához szükséges területeken belül, beleértve (de nem korlátozva ezekre) azokat a géneket, amelyek megszabják az antibiotikum-módosító enzimeket, az antibiotikum-rezisztenciát és az antibiotikum-szintézist, valamint a szabályozó gének összes típusát. Még részletesebben, egy olyan nem-kiválasztható DNS szegmens, amely egy gént tartalmaz, iktatható be egy plazmidba, pl. a bemutatott pHJL210 plazmidba, az egyedi BanMl restrikciós helynél. Egy ilyen beiktatás inaktiválja a neomicin rezisztencia génjét és Így lehetővé teszi a rekombináns plazmidot tartalmazó transzformánsok könnyű azonosítását. Ezt el lehet végezni először a tiosztrepton-rezisztens transzformánsok kiválasztásával, majd az olyan tiosztrepton-rezisztens transzformánsok azonosításával, amelyek neoraicinre nem rezisztensek. Hasonló módon egy szóban forgó DNS szegmens beiktatása pl. az egyedi Clal restrikciós helynél inaktiválja a tiosztrepton rezisztencia gént. így azok a transzformánsok', amelyek ezt a rekombináns plazmidot hordozzák, szintén könnyen azonosíthatók először neomicin-rezisztenciára kiválasztva, majd azonosítva azokat a neomicin-rezisztens transzformánsokat, amelyek nem rezisztensek tiosztreptonra. Ennél fogva a képesség az antibiotikum-rezisztencia kiválasztására Streptoraycesben és rokon sejtekben lehetővé teszi a különösen ritka olyan sejtek hatásos izolálását, amelyek a szóban forgó nem-kiválasztható DNS-t tartalmazzák. A fentebb itt leirt, antibiotikum-rezisztenciához való működési vizsgálatot alkalmazni lehet azoknak a DNS szegmenseknek a lokalizálásához, amelyek az antibiotikum rezisztencia gének szabályozójaként, vagy bioszintézis elemeként és közvetlen kifejezőjeként működnek. Az ilyen szegmensek, beleértve (de nem csak ezekre korlátozva) a promotorokat, gyengítőket (attenuátorókát), represzszorokat, induktorokat, riboszomális kötőhelyeket és hasonlókat, alkalmazhatók a Streptomycetes és rokon organizmusok sejtjeiben levő más gének kifejeződésének szabályozásához. A jelen találmány szerinti antibiotikum-rezisztencia átadó vektorok alkalmazhatók annak biztosítására, hogy a kapcsolt DNS szegmensek stabilan meg legyenek tartva a gazdasejtekben több generáción keresztül. Ezeket a géneket vagy DNS fragmenseket, amelyek kovalensen kötöttek egy antibiotikum rezisztencia átadó fragmenshez és vagy Streptomycetesben vagy E. coliban szaporodnak, úgy tartják fenn, hogy a transzformánsokat olyan antibiotikum-szintnek tesszük ki, amely toxikus a nem transzformált sejtekre. Ennél fogva azok a transzformánsok, amelyek elvesztik a vektort és következésképpen mindenféle kovalensen kötött DNS-t, nem tudnak nőni és kiküszöbölődnek a tenyészet-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
