197352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pHJL 210 plazmid és más, ezzel összefüggő kétfunkciós klónozó vektorok előállítására Streptomycetesben való alkalmazáshoz
22 197352 23 K 12 C600Rk-Mk-/pHJL 201, E. coli K 12 C600Rk-Mk-/pHJL200, E. coli K 12 C600Rk-Mk-/pHJL202, E. coli K 12 C600Rk-Mk-/ /pHJL203, E. coli K 12 C600Rk-Mk-/pHJL204 és E. coli K 12 C600Rk-Mk-/pHJL205 transzformánsokat. Az ampicillin-rezisztens èe tetraciklin-érzékeny telepeket ismert eljárások szerint izoláljuk, tenyésztjük, és a kovalensen zárt cirkuláris DNS tisztítására használjuk, amelyet azonban hagyományos módon azonosítunk restrikciós enzimmel és az alkotó plazmidok AGE elemzésével. Az azonosított transzformánsokat használjuk azután a PHJL201, pHJL200, pHJL202, pHJL203, pHJL204, és pHJL205 plazmidok termelésére és izolálására az 1. példában található kitanitás szerint azzal a különbséggel, hogy a kívánt plazmidot tartalmazó törzseket alkalmazzuk az E. coli K 12 C600Rk-Mk-/pJL192 helyett. A pHJL201 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 4. ábra mutatja be. Az 5. ábra mutatja be a PHJL200, pHJL202, pHJL203, pHJL204, és pHJL205 plazmidok restrikciós hely- és működési térképét. 6. példa A pHJL210 és pHJL211 plazmidok megalkotása A. A pHJL201 plazmid részleges BamHI emésztése Mintegy 10 pl (10 jug) pHJL201 plazmidot (amelyet az 5. példában található kitanítás szerint készítünk el), 5 iA BSA-t (1 mg/rnl), 29 ül vizet, 1 ul BamHI restrikciós enzimet (vízzel 1:4 arányban hígítva) és 5 aiI BamHI reakciókeveréket inkubálunk 37 °C hőmérsékleten 15 percen át. A reakciót 70 °C hőmérsékleten 10 percen át történő melegítéssel állítjuk le. A plazmid teljes hosszúságú lineáris molekulájának megfelelő részleges emésztési termékeket megtisztítjuk a kisebb, teljesen emésztett termékektől AGE-vel, az 1. példában található kitanitás szerint. A DNS-t lényegileg a 4. példában található kitanítás szerint kicsapjuk. Az így nyert DNS-csapadékot 20 a«1 vízben újra szuszpendáljuk az ezt követő ligáláshoz. B. A pLR2 plazmid mintegy 1 kb-s Bel I restrikciós fragmensének izolálása A legtöbb E. coli K 12 törzs metilez bizonyos gyököket saját DNS-ében. így pl. a dam gén által szabályozott metiláz a jelzett adenin N6 helyzeténél metilez az ^GA^TC3' DNS szekvenciában. Erről a metilezésről kimutatták, hogy megakadályoz néhány (de nem minden) restrikciós endonukleáz által végzett DNS-hasitást, amely endonukleázok felismerő szekvenciái tartalmazzák vagy magukban foglalják a metilezett szekvenciákat. A jelen találmányban gyakran alkalmazott Bel I restrikciós enzim nem hasítja a Bel I felismerő szekvenciát, az 5’TGATCA3’-t, ha az metilezve van. Hogy elkerüljük ezt a problémát, a pLR2 plazmidot át kell vinni egy E. coli danr törzsbe, pl. GM48-ba, amely letétbe van helyezve a Northern Regional Research Laboratory-nál (NRRL) (Peoria, Illoinis), és ennek a gyűjteménynek állandó részét képezi. A törzs a közönség rendelkezésére áll NRRL B-15 725 letéti számon. A kívánt emésztést ez utón lényegében a 2 B példában található kitanítás szerint hajtjuk végre azzal a kivétellel, hogy Bel I restrikciós enzimet alkalmazunk BamHI restrikciós enzim helyett. A mintegy 1 kb-s Bel I restrikciós fragmenst AGE-vel tisztítjuk az 1. példában található kitanítás szerint. C. Ligálás A kívánt ligálást lényegében a 2 C példában található kitanítással összhangban hajtjuk végre. Különböző szerkezetű plazmidok képződhetnek, de a kívánt rekombináns plazmidok azok, amelyek fenotipusosan átviszik a rezisztenciát neomícinre és tiosztreptonra. Ezen kívül két orientációjú rekombináns plazmidokat készítünk, mivel a mintegy 1 kb-os Bel I rezisztencia átadó fragmenst mindegyik irányba lehet orientálni. A PHJL210 és pHJL211 restrikciós hely- és működési térképet a melléklet ábrák közül az 5. ábra jeleníti meg. 7. példa Az E. coli K 12 C60ÓRk-Mk-/pHJL210 és E, coli K 12 C600Rk-Mk-/pHJL211 megalkotása A kívánt konstrukciókat egyenként alkotjuk meg, kiválasztjuk és kinyerjük, lényegében az 5. példában található kitanítással összhangban, azzal a kivétellel, hogy a PHJL210 és pHJL211 plazmidokat használjuk a PHJL200, pHJL201, pHJL202, pHJL203, pHJL204 és pHJL205 helyett. 8. példa Streptomyces griseofuscus/pHJL201, S. griseofuscus/pHJL210 és S. griseofuscus/pHJL211 megalkotása A kívánt konstrukciókat egyenként alkotjuk meg, kiválasztjuk és kinyerjük, lényegében a 3. példában található kitanítással összhangban azzal a kivétellel, hogy a pHJL201 plazmidot és nem a pHJL2200 plazmidot alkalmazzuk, és a kiválasztásban fedó-agarként megfelelő mennyiségű neomicint 13 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
