197352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pHJL 210 plazmid és más, ezzel összefüggő kétfunkciós klónozó vektorok előállítására Streptomycetesben való alkalmazáshoz
24 197352 25 tartalmazó (hogy a végső leme2koncentráció 2 /ul/ml neomicin legyen) agart használunk tiosztreptont tartalmazó agar helyett. Hasonlóképpen a pHJL210 és pHJL211 megalkotását egyenként végezzük, kiválasztjuk és kinyerjük lényegében a 3. példában lévő kitartással összhangban, azzal a kivétellel, hogy a pHJL210 és pHJL211 plazmidokat alkalmazzuk a pHJL2202 helyett. 9. példa A Streptomyces lividans/pHJL210, S. lividans/pHJL210 és S. lividans/pHJL211 megalkotása A kívánt konstrukciókat egyenként alkotjuk meg, kiválasztjuk és kinyerjük lényegében a 8. példában található kitanitással összhangban, azzal a kivétellel, hogy S. griseofuscus helyett Streptomyces lividans-t alkalmazunk. A S. livadans régi és jól ismert törzs, amely a köz rendelkezésére áll NRRL B-15 826 letéti számon, amely a Northern Regional Research Laboratorynál (Peoria, Illinois) van letétbe helyezve, és annak részét képezi. Ezen kívül a S. lividans növesztéséhez és protoplasztképzéséhez tartozó tápközeg, a protoplaszt készítése és a transzformáció olyan, amelyet az International Publicationban leírtak, a PCT/BG79/00 095 nemzetközi szabadalmi bejelentésnél, amelynek közzétételi száma W0679/01 169, a 2. példában. Az azonosított transzformánsokat alkalmaztuk azután a pHJL201, pHJL210 és pHJL211 plazmidok előállításához és izolálásához ismert módszerek szerint, lényegében úgy, ahogyan ez a 3 C példa kitanításában le van Írva. 10. példa A Streptomyces fradiae/pHJL201, S. fradiae/pHJL210 és S. fradiae/pHJL211 megalkotása A kívánt konstrukciókat egyenként alkotjuk meg, kiválasztjuk és kinyerjük, lényegében a 8. példában található kitanitás szerint azzal a különbséggel, hogy Streptomyces fradiae-t alkalmazunk S. griseofuscus helyett. A S. fradíae régi és jól ismert törzs, amely a köz rendelkezésére áll ATCC 19 609 letéti számon, és amely az American Type Culture Collection-nál (12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852) van letétbe helyezve és annak részét képezi. Ezen kívül a TSB tápközeget a S. fradiae növesztéséhez és protoplaszt-képzéshez módosítjuk olyan formán, hogy csak 0,2% glicint tartalmaz. A S. fradiae nagyon kis gyakorisággal transzformál az endogén restrikciós rendszer miatt, ezért a transzformánsok száma DNS 14 milligrammonként lényegesen kisebb a PHJL201, pHJL210 és pHJL211-el transzformáit S. fradiae gazdaszervezeteknél, mint a S. griseofuscus vagy S. lividans gazdaszervezeteknél. A S. fradiae-ből izolált plazmid DNS azonban nagy gyakoriságú transzformálást ad, amikor ezt visszatranszformáljuk S. fradiae-ba. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás mérsékleten nagy kópiaszámú rekombináns DNS klózozó vektor előállítására azzal jellemezve, hogy a.) a pJLI92 plazmid replikációt tartalmazó restrikciós fragmensének egy mintegy 2,5 kb-s Kpn I kiindulását és b.) egy vagy több olyan DNS szegmenst, amely legalább egy antibiotikumra ad át rezisztenciát, amikor érzékeny, restrikció nélküli gazdasejtre visszük át, egyesítünk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás PHJL2200 és pHJL2201 plazmidok előállításéra azzal jellemezve, hogy a pHJL192 plazmid mintegy 2,5 kb-s Kpn I restrikciós fragmensét és a pLR2 plazmid végeinél Kpn I kapcsolókkal rendelkező, mintegy 1,6 kb-s BamHI restrikciós fragmensét ligáljuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás PHJL2202 és pHJL2203 plazmidok és ezek beiktatásos izomerjeínek előállítására azzal jellemezve, hogy a pHJL2200 plazmid részleges Bel I emésztésével nyert anyagot és a pLR4 plazmid mintegy 3,4 kb-s BamHI fragmensét ligáljuk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás a PHJL200, PHJL201, pHJL202, pHJL203, pHJL204 és pHJL205 plazmidok előállítására azzal jellemezve, hogy a pJL192 plazmid DNS-t Kpn I restrikciós enzimmel emésztünk, a reakciókeverékből az emésztés során a 15., 30., 60., 90. és 120, percben alikvotokat veszünk, az egyes alikvot minták DNS fragmenseit ligázzal inkubáljuk az önkörbezárás elősegítésére, az alikvotok mindegyikének egy mintáját baktérium-sejttel inkubáljuk a transzformálás kivitelezésére, a transzformált sejteket fenotípus alapján kiválasztjuk, a kiválasztott, transzformált sejteket plazmid-méret szerint osztályozzuk, és a mintegy 7,2 kb-s, mintegy 9,9 kb-s, mintegy 18 kb-s, mintegy 15,3 kb-s, mintegy 10,6 kb-s és mintegy 12,6 kb-s plazmidokat hagyományos módon izoláljuk és azonosítjuk, amely plazmidokat pHJL200-nak, illetve pHJL201-nek, illetve pHJL202-nek, illetve pHJL203-nak, illetve pHJLk204-nek, illetve pHJL205-riek nevezzük el. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás a pHJL210 és pHJL211 plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy E. coli dam-törzsből izolált pLR2 plazmid mintegy 1 kb-s Bel I restrikciós fragmensét és a pHJL201 plazmid részleges BamHI emésztésével kapott anyagot ligáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
