197352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pHJL 210 plazmid és más, ezzel összefüggő kétfunkciós klónozó vektorok előállítására Streptomycetesben való alkalmazáshoz
20 197352 21 bahőmérsékleten 20-30 percen át, hogy lizáljuk a sejteket. Ezután 8 ml 5 mól/literes NaCl oldatot adunk hozzá és enyhén keverjük szobahőmérsékleten 30 percen át, majd a sejteket l*/2 órára jégre helyezzük. A DNS-t centrifugálással nyerjük ki, Sorvall-rotorban 15 000 fordulat/percnél 20 percen át. A felülúszót összegyűjtjük és a DNS-t 0,64 térfogat izopropanollal kicsapjuk és 20 percen át 10 000 fordulat/percnél centrifugáljuk. A felülúszót elöntjük, és a szemcséket levegőn szárítjuk, majd 10 ml TE pufferban újra szuszpendáljuk. Ezt azután CsCl gradiens-kiegyensúlyozással lehet tisztítani, az 1. példában található kitanitás szerint. 4. példa (I) pHJL200, pHJL201, pHJL202, PHJL203, pHJL204, és pHJL205, valamint (II) E. coli K 12 C600Rk-Mk-transzformánsaik megalkotása 1. A plazmidok megalkotása A. A pJL192 plazmid részleges Kpn I emésztése A következő emésztést hajtjuk végre. Mintegy 13 pl pJL192 DNS-t (kb. 3,25 pg) (az 1. példában található kitanitás szerint készítve), 25 pl vizet, 5 pl BSA-t, 5 pl 10-szeres Kpn I restrikciós puffert és 2 pl Kpn I enzimet összekeverünk és 37 °C hőmérsékleten inkubálunk. A 15., 30., 60., 90. és 120. percben 10 pl-es alikvotokat veszünk, 40 pl vízzel keverjük ezeket, és 70 °C hőmérsékleten melegítjük 10 percen át. Ez a művelet az összes létező reakcióterméket létrehozza, attól a molekulától kezdve, amelyet a Kpn I restrikciós enzim nem hasított el, egészen addig, amelyet a Kpn I restrikciós enzim teljesen megemésztett. Ezeket az alikvotokat 1/10 térfogat 3 mól/literes NaCAC oldattal (pH 8) és 2 térfogat etanollal kicsapatjuk és -70 °C ^hőmérsékleten 1 órán át fagyasztjuk. B. Ligálás Az egyes csapadékokat Összegyűjtjük, kétszer mossuk, levegőn szárítjuk, majd 20 pl vízben újra szuszpendáljuk. Minden szuszpenzióból 6 pl-t kiveszünk és olyan oldattal keverjük, amely 20 pl 5-szörös kináz//ligáz puffert*, 40 pl 0,66 mól/literes ATP-t (pH 7,4), 33 pl vizet és lpl T4 DNS ligázt (Boehringer Mannheim, ~1 egység (pl) tartalmaz, majd 15 °C hőmérsékleten 72 órán át inkubáljuk, hogy elősegítsük az ön-körbezéródást. Inkubálás után minden szuszpenzióból 50 pl-t kiveszünk és a reakciót befejezzük, a hőmérsékletet 10 percre 70 °C hőmérsékletre emelve. Ezeket a szuszpenziókat a fentiek szerint kicsapjuk, és 15 pl vízben újra szuszpendáljuk. * Az 5-szórös kináz/ligáz puffert a következő összeállítás szerint készítjük el: 250 mmól/liter Tris-HCl, pH 7,8 25% glicerin 25 mmól/liter ditiotreitol, 50 mmól/liter MgCU 5. példa II. E. coli K 12 C600Rk-Mk-/pHJL201, E. coli K 12 C600Rk-Mk-/pHJL200, E. coli K 12 C600Rk-Mk~/pHJL202, E. coli K 12 C600Rk-Mk-/pHJL203, E. coli K 12 C600Rk~Mk~/pHJL204, E. coli K 12 C600Rk-Mk-/pHJL205 megalkotása. A. A megfelelő fagyasztott E. coli K 12 C600Rk-Mk-elöállitása E. coli K 12 C600Rk-Mk-, egy széles körben elterjedt és az ATCC-nél ATCC 33525 letéti számon elhelyezett törzs friss, egy éjszakán át nőtt tenyészetéből másod-tenyészetet készítünk, 1:10 arányban oltva friss L-tápközeget [amelynek összetételét ismerteti Miller: Experimenst in Molecular Genetics (Kísérletek a molekuláris genetikában), Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York, /1972/] oltva, majd ezt 37 °C hőmérsékleten 1 órán át növesztjük. Összesen 660 Klett-egység sejtet nyerünk ki, 2,5 ml 100 mmól/literes NaCl oldattal mossuk, 2,5 ml 150 mmól/literes CaClz oldatban szuszpendáljuk, és szobahőmérsékleten inkubáljuk 20 percen át. A sejteket centrifugálással kinyerjük, 0,5 ml 150 mmól/liter CaClz -10% glicerin oldatban újra szuszpendáljuk, jégben hűtjük 3-5 percen át, majd fagyasztjuk. A sejtek szuszpenzióját folyékony nitrogénben tároljuk felhasználásig. A tartósítás és tárolás nem befolyásolja károsan a kovalensen zárt cirkuláris DNS-el történő transzformálás megvalósíthatóságát és gyakoriságát. B. Transzformálás A megfelelő sejteket jégfürdőben felmelegedtetjük és 0,1 ml sejt 0,05 ml DNS-hez arányban összekeverjók [a DNS: 12,5 pl a 4 B és 6 C példákban bemutatott mintából és 37,5 pl 0,1-szeres SSC (0,015 mól/liter NaCl, 0,0015 mól/liter nátríum-citrát, pH 7)J. A transzformáló keveréket jégben hűtjük 20 percen át, hővel sokkoljuk 42 °C hőmérsékleten 1 percen át, majd jégen hűtjük 10 percen át. A mintákat ezután 0,85 ml L-tápközeggel hígítjuk, 37 °C hőmérsékleten 1,5 órán át inkubáljuk, 50 pg/ml ampicillint is tartalmazó L-agarra szélesztjük és 18 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten az E. coli 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
