197352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pHJL 210 plazmid és más, ezzel összefüggő kétfunkciós klónozó vektorok előállítására Streptomycetesben való alkalmazáshoz
2 197352 3 A jelen találmány tárgyai kiválasztható új, mérsékelten nagy kópiaszámú rekombináns DNS klónozó vektorok, amelyek pJL 129 plazmid replikációt tartalmazó restrikciós fragmensének mintegy 2,5 kb méretű Kprtl eredőjét és egy vagy több olyan DNS szegmenst tartalmaznak, amelyek rezisztenciát visznek át legalább egy antibiotikumra, amikor transzformálják ezeket érzékeny, restrikció nélküli gazdasejtbe. A vektorok tartalmaznak egy mutáns Streptomycetes replikont, amely növeli a mutáns replikont tartalmazó plazmidok kópiaszámát a pJL 192-ben levő vadtípusú replikont tartalmazó plazmidokhoz képest. A találmány tárgyai továbbá azok a transzformánsok is, amelyek a fentebb említett vektorokat tartalmazzák. A kiválasztható és mérsékelten nagy kópiaszámú plazmidok (kb. 50 kópia sejtenként) Streptomycetesben és rokon gazdasejtekben alkalmazhatók. Eddig a rekombináns DNS technika fejlődése és kimunkálása Streptomycetesben gátolt volt és különleges nehézségeket okozott a mérsékelten nagy kópiaszámú vektorok általános hiánya miatt. Korábban nagyon nagy, több száz kópia/sejt kópiaszámú vektorok és kis, 1-5 kópia/sejt kópiaszámú vektorok álltak rendelkezésre. A mérsékelten nagy kópiaszámú plazmidok megjelenése olyan eszközt ad, amelynek segítségével az ezeken a mérsékelten nagy kópiaszámú plazmidokon hordozott gének által kódolt fehérjék kitermelése megnővekedett, amikor összehasonlitjuk a kis kópiaszámú plazmidokon hordozott génekből való kifejeződés szintjével. így a mérsékelten nagy kópiaszámú plazmidok előnyösek gyengén átírt vagy átfordított Streptomycetesbe klónozott gének kifejeződésének nyerésében a halálos kifejeződés problémái nélkül, amelyek előfordulhatnak nagyon nagy kópiaszámú plazmidokkal. A jelen találmány szerinti vektorok mérsékleten nagy kópiaszámban léteznek, és működőképesek és kiválaszthatók mind Streptomycetesben, mind más gazdasejtekben és ezért jelentős előnyt mutatnak a technika eddigi állásához képest. Ezek a vektorok különösen hasznosak, mivel ezek viszonylag kicsik, sokoldalúak és képesek transzformálni és kiválasztódni bármily Streptomycetes sejtben, amely olyan antibiotikumra érzékeny, amelyhez a rezisztencia átvihető és ahol a mutáns replikon kielégítő információt nyújt az önreplikációhoz. Mivel a természetben előforduló antibiotikumok több, mint 70 százalékát Streptomycetes törzsek termelik, kívánatos kifejleszteni olyan klónozó rendszert és vektorokat, amelyek alkalmazhatók ehhez az iparilag fontos csoporthoz. A jelen találmány ilyen vektorokat nyújt és Így lehetővé teszi gének klónozását Streptomycetesbe mind az isméit antibiotikumok kitermelésének növelése, mind új antibiotikumok és antibiotikum-származékok termelése érdekében. A vektorok hordozókat is nyújtanak a DNS klónozásához Streptomycetes gazdasejtekbe és lehetővé teszik a transzformánsok kényelmes kiválasztását. Mivel a transzformáció nagyon kis gyakoriságú esemény, egy ilyen működési vizsgálat gyakorlati szükségszerűség annak meghatározásában, mely Bejtek a sejtek billiói küzül fogadták be a plazmid DNS-t. Ez fontos, mivel a DNS szekvenciák, amelyek önmagukban nem szelektálhatok, beiktathatok a vektorokba, és a vektort és különösen a szóban forgó DNS szekvenciát tartalmazó sejteket transzformáció esetén megfelelő fenotipusos szelekcióval izolálni lehet. A jelen találmány céljaira, ahogyan ezt a leírás későbbi részében és az igénypontokban használjuk, a következő kifejezéseket határozzuk meg.- Rekombináns DNS klónozó vektor - bármilyen függetlenül replikálódó ágens (beleértve a plazmidokat is, de nemcsak ezekre korlátozva), amely egy olyan DNS molekulát tartalmaz, amelyhez egy vagy több további DNS szegmenst lehet hozzáadni vagy adtak hozzá.- Transzformálás - DNS bevezetése egy befogadó gazdasejtbe, amely DNS megváltoztatja a genotípust és az következésképpen változásokat okoz a befogadó sejtben.- Transzformáns-befogadó gazdasejt, amely a transzformálásnak alá volt vetve.- Érzékeny gazdasejt - olyan gazdasejt, amely nem nő egy adott antibiotikum jelenlétében egy olyan DNS nélkül, amely átruházza neki a rezisztenciát.- Restrikciós fragmens - bármilyen lineális DNS, amely egy vagy több restrikciós enzim működése révén alakult ki.- Beiktatási izomer - a két vagy több lehetséges rekombináns DNS molekula egyike, amely molekulák akkor keletkeznek, amikor egy DNS fragmens van beiktatva a befogadó DNS-en levő két vagy több versengő hely egyikébe, vagy amikor egy DNS fragmens van beiktatva a két reciprok irány egyikébe, amely lehetséges a befogadó DNS egy helyénél.- Replikon - olyan DNS szekvencia, amely szabályozza és lehetővé teszi a DNS replikációját.- Replikáció (replikon) E. coli eredettel - olyan DNS szekvencia, amely szabályozza és lehetővé teszi egy plazmid vagy más vektor replikációját E. coliban.- Replikáció (replikon) Streptomycetes eredettel - olyan DNS szekvencia, amely szabályozza és lehetővé teszi egy plazmid vagy más vektor replikációját Streptomycetesben.- ApR - az ampicillin-rezisztens fenotipus.- Tcs - a tetraciklin-érzékeny fenotipus.- NmR - a neomicin-rezisztens fenotipus 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
