197352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pHJL 210 plazmid és más, ezzel összefüggő kétfunkciós klónozó vektorok előállítására Streptomycetesben való alkalmazáshoz
4 197352 5- Ts® - a tiosztrepton-rezisztens fenotipus- kb - kilobázis, vagyis 1000 nukleotid-pár A továbbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást. A mérsékelten nagy kópiaszámú rekombináns DNS klónozó vektor a következőkből áll. a. ) a pJL 192 plazmid replikációt tartalmazó restrikciós fragmensének mintegy 2,5 kb-s Kpn I kiindulásából; b. ) egy vagy több DNS szegmensből, amelyek egy vagy több antibiotikumra való ellenállást szállítanak, amikor transzformálják ezeket az érzékeny, restrikció nélküli gazdasejtbe. A találmány továbbá magában foglalja a fentebb említett 1 vektorok transzformánsait is. A jelen találmány szerinti vektorokat úgy alkotjuk meg, hogy egy vagy több antibiotikum-rezisztenciát átruházó DNS szegmenst ligálunk (vagyis összekapcsolunk) a pJL 192 plazmid replikációt tartalmazó restrikciós fragmensének mintegy 2,5 kb-s Kpn I kiindulásával. Az igy létrejött vektort lehet azután ligálni egy E. coli plazmid egy replikációt tartalmazó és antibiotikum-rezisztenciát átruházó funkcionális kiindulásával, olyan őnreplikáló kétfunkciós vektorokat állítva elő, amelyek kiválaszthatók mind E. coliban, mind Streptomycetesben. A pJL 192 plazmidot hagyományosan izolálhatjuk E. coli K12 C 600Rk-Mk-/pJL törzsből, amely törzs letétbe van helyezve a Northern Regional Research Laboratory-ban (NRLL) (Peoria, Ilinois 61604). A törzs a köz rendelkezésére áll, mint a plazmid előnyös forrása és tárolója, az NRLL B-15 040 letéti számon. A pJL 192 plazmid restrikciós helyeinek térképét a mellékelt rajzokból az 1. ábra mutatja be. A jelen bejelentés céljaihoz az 1. ábra és az összes további rajzok nem mérethelyesen vannak ábrázolva. Bár a pJL 192 plazmid replikációt tartalmazó fragmenseinek több különböző Streptomycetes-kiindulását lehet megalkotni, az itt bemutatás céljából példákba szedett fragmenseket azzal a ténnyel lehet jellemezni, hogy mind tartalmazza a mintegy 2,5 kg-s Kpn I restrikciós fragmenst. Ez a mintegy 2,5 kb-s Kpn 1 restrikciós fragmens a pJL 192 plazmid teljes Kpn I enzimes emésztése sorén keletkezik, és erről úgy találtuk, hogy mérsékelten nagy kópiaszámú (40-50 kópia sejtenként) plazmid-származékot alkot. A pJL 192 plazmid egy mintegy 5,9 kb-s EcöRiSal I replikon fragmenst tartalmaz az SCP2* Streptomycetes-plazmidból, amely plazmidról ismeretes, hogy kis kópiaszámmal rendelkezik, azaz egy-őt kópia/sejt számmal. Úgy véljük, hogy az SCP2* kópiaszámot ellenőrző, szabályozó szekvencia jelentős mutációt szenvedett a replikációt tartalmazó mintegy 4 5,9 kb-s EcoKl-SAl I fragmens SCP2* kiindulásának a mintegy 2,5 kg-s Kpn I restrikciós fragmenshez való, jelen találmány szerinti hozzányesése során. A Streptomyceteshez való kívánatos klónozó vektoroknak tartalmaznia kell olyan plazmid replikációs funkciókat, amelyek Streptomycetesben kifejeződnek, valamint két antibiotikum-rezisztencia markert, előnyösen egy restrikciós enzim számára egyedi felismerési hellyel minden egyes rezisztencia-markerban. Abból a célból, hogy ideális klónozó vektort alkossunk meg, a pJL 192 plazmid replikációt tartalmazó mintegy 2,5 kb-s Kpn I kiindulását külön-külön egy vagy több antibiotikum-rezisztenciát átadó DNS fragmensekhez ligáljuk (itt bemutatás céljából a pLR2 plazmid tiosztrepton-rezisztencia átadó, mintegy 1,6 kb-s BamHI restrikciós fragmensét és a pLR4 plazmid neomicin-rezisztencia átadó, mintegy 3,4 kb-s Bandii restrikciós fragmensét adjuk meg), a jelen találmányhoz bemutatásra alkalmas vektorokat képezve. A pLR2 és pLR4 plazmidokat, amelyek a tiosztrepton-, illetve a neomicin-rezisztencia átadó fragmensek forrásai, a 4 416 994 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás tárgyát képező eljárással alkothatjuk meg. Mind a pLR2, mind a pLR4 plazmidok funkcióképesek E. coliban, ezért sokszorozhatok és izolálhatók kényelmesen az ezt követő műveletekhez. A megalkotás kényelmessége és megkönnyítése érdekében a tiosztrepton-rezisztenciát átadó mintegy 1,6 kb-s Bandii fragmenst és a neomicin-rezisztenciát átadó mintegy 3,4 kb-s BamHI fragmenst a pJL 192 plazmid replikációt tartalmazó fragmensének mintegy 2,5 kb-s Kpríl kiindulásához ligáljuk, a jelen találmányhoz bemutatásul szolgáló plazmidokat állítva elő. A kívánt rekombináns plazmidokból két orientjációjú jöhet létre a beiktatott DNS fragmens orientációjától függően. igy pl. a pLR2 plazmid mintegy 1,6 kb-s fragmensének beiktatása a pJL 192 plazmid mintegy 2,5 kb-s Kpríl restrikciós fragmensébe a bemutatott pHJL 2200 és pHJL 2201 plazmidokat eredményezi; hasonlóképpen a mintegy 3,4 kb-s BamHI fragmens beiktatása a pHJL 2200-ba a bemutatott pHJL 2202 és pHJL 2203 plazmidokat eredményezi. Bár az itt példákba szedett tiosztrepton- és neomicin antibiotikum rezisztencia átadó DNS szegmensek a pLR2 illetve pLR4 mintegy 1,6 kb-s, illetve mintegy 3,4 kb-s BamHI restrikciós fragmensei, azok, akik a szakterületen jártasak, alkothatnak és használhatnak vagy egyedül, vagy kombinációban további DNS szegmenseket is, amelyek szintén adnak át tiosztreptonre és neomicinre való rezisztenciát. A pLR2 további tiosztreptonátadó DNS szegmensei lehetnek pl. a mintegy 13 kb-s Psü restrikciós fragmens, valamint a mintegy 1 kb-s BcR restrikciós fragmens is. A pLR4 plazmid további neomicin-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
